青藤碱对大鼠小肠移植后缺血/再灌注损伤的保护作用*

周 利杨莎莎吴胜英

（1.湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院 湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院基础医学院，湖北 十堰 442000）

·研究报告·

青藤碱对大鼠小肠移植后缺血/再灌注损伤的保护作用*

周 利1杨莎莎1吴胜英2△

（1.湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院 湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院基础医学院，湖北 十堰 442000）

目的观察青藤碱对同种异体大鼠小肠移植后缺血/再灌注损伤的影响，研究其保护机制。方法将小肠移植后的40只受体SD大鼠随机分为缺血/再灌注组和青藤碱干预组，另取16只SD大鼠为对照组。术后青藤碱干预组用10%青藤碱［10 mL/（kg·d）］灌胃干预性治疗14 d，对照组及缺血/再灌注组按［10 mL/（kg·d）］灌0.9%氯化钠注射液。采用EnVision二步法检测小肠黏膜组织CC趋化因子受体5（CCR5）和β-抑制蛋白2（β-arrestin 2）和β-arrestin 2-mRNA的表达，ELISA试剂盒检测小肠组织一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）。结果青藤碱可降低大鼠小肠组织NO和MDA，提高T-SOD，且青藤碱干预组小肠黏膜β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA高表达，CCR5低表达，与缺血/再灌注组和同组干预前比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论青藤碱可明显抑制小肠移植后脂质过氧化反应、并通过影响β-arrestin 2和CCR5的表达来调节小肠移植后局部免疫反应，对同种异体大鼠小肠移植后缺血/再灌注损伤有保护作用。

青藤碱 同种异体小肠移植 CC趋化因子受体5 β-抑制蛋白2 缺血/再灌注

氧自由基可诱导脂质过氧化反应，其分解产物丙二醛（MDA）对机体产生损害作用，超氧化物歧化酶（SOD）作为特异性抗氧化酶，可清除超氧阴离子，减轻脂质过氧化产物MDA对机体产生损害而起细胞保护作用［1］。近年来研究发现氧自由基及一氧化氮（NO）与肠道炎症及肿瘤的发生发展有一定的相关性，NO作为神经毒性因子，在超氧阴离子存在时会产生毒性作用，加剧缺血/再灌注损伤，一氧化氮合成酶（NOS）是合成NO的酶，与NO呈正相关［2］。CC趋化因子受体5（CCR5）可诱导白细胞向肠道组织内迁移、聚集、浸润，导致肠黏膜发生炎症性损害［3］。β-抑制蛋白2（β-arrestin 2）为细胞内一种可溶性蛋白质，可与磷酸化活化的CCR5结合，介导CCR5的脱敏与内化，参与肠道免疫反应过程［4］。β-arrestin 2和CCR5参与小肠肠道免疫反应调节和炎症反应过程，有明显的负相关特点，在有炎症浸润时，肠道黏膜CCR5高表达，β-arrestin 2低表达［5］。本研究先建立同种异体SD大鼠小肠移植模型，观察青藤碱在移植后对缺血/再灌注损伤的影响，研究其保护机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠96只，SPF级，鼠龄8周，体质量（165±10）g，实验动物生产许可证［SCXK（鄂）2013-0008］，实验动物设施使用许可证［SYXK（鄂）2013-0031］。

1.2 药品与试剂 青藤碱 （烟台鲁银药业有限公司，批号2016052320）；肝素钠（上海第一生化药业有限公司，批号1631022051）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批号H0160212）、乳酸林格氏液（杭州民生药业有限公司，批号H01633020035）；MDA、NO、NOS及TSOD ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，编号061125，061127，X061241，X061273）。

1.3 造模与分组 参照文献［6］，取供体SD大鼠40只，分别称质量，按0.35mL/100 g的剂量，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉后仰卧位固定，碘伏消毒备皮，切开腹部皮肤，充分暴露腹腔。自回盲部开始，分别分离结扎结肠系膜血管，使结肠与十二指肠分离。小心分离结扎肠系膜前动静脉、淋巴管，理顺肠道，切开十二指肠，用0.9%氯化钠注射液5 mL灌肠，然后沿腹腔干分离门静脉与肠系膜动脉并结扎脾静脉。分离肾下腹主动脉并结扎腹主动脉，用4℃肝素乳酸林格氏液灌注2～5 min，待肠管变白后剪腹主段小肠约5 cm，置于4℃乳酸林格氏液冰盒备用。取受体SD大鼠40只，受体手术同供体，但不灌注小肠，在切与供体相同部位的小肠后，在双目连续变倍体视显微镜下吻合小肠平滑肌、小肠动、静脉、淋巴管，然后用缝合腹壁肌层各皮肤，消毒，庆大霉素注射液（每次10mg）肌肉注射1周预防感染。40只SD受体大鼠造模后随机分为缺血/再灌注组和青藤碱干预组，每组20只，另取16只大鼠为对照组，对照组不实施移植手术作为空白对照。

1.4 治疗方法 术后青藤碱干预组用10%青藤碱［10mL/（kg·d）］灌胃干预性治疗14 d，对照组及缺血/再灌注组按［10mL/（kg·d）］灌0.9%氯化钠注射液。本实验在干预性治疗14 d后，缺血/再灌注组大鼠存活14只，青藤碱干预组大鼠存活18只。

1.5 检测指标 取治疗前大鼠8只和干预14 d时所有存活大鼠，处死，切取小肠组织2 cm，放入浓度为1 mmoL/L的HCL液100 mL中研磨混匀，制小肠组织匀浆液，4℃低温离心10min（3000 r／min）。取上清液于-70℃液氮中保存待检。测定前将标本置于冷水中复融，再次4℃低温离心10min（3000 r／min），然后取上清液，按试剂盒说明用ELISA试剂盒检测小肠组织匀浆液中NO、NOS、T-SOD和MDA［7］；采用EnVision二步法检测小肠β-arrestin 2、β-arrestin 2-mRNA和CCR5的表达［8］。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量数据以（±s）表示，各组指标比较采用单因素方差分析，组间和两样本两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠治疗前后NO、NOS、T-SOD和MDA水平比较 见表1。对照组大鼠NO、NOS、T-SOD和MDA治疗前后无明显变化，与同组干预前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。缺血/再灌注组T-SOD在治疗前后保持低水平，NO、NOS和MDA高水平，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。青藤碱干预组T-SOD明显升高，NO、NOS和MDA降低，与缺血/再灌注组和同组干预前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠治疗前后NO、NOS、T-SOD和MDA水平比较（±s）

表1 各组大鼠治疗前后NO、NOS、T-SOD和MDA水平比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05，与同组干预前比较，△P＜0.05，与缺血/再灌注组比较，▲P＜0.05。下同。

NO（μmol/mL）NOS（μmol/mL）T-SOD（μmol/mL）MDA（nM/mL）28.67±3.19 19.59±1.17 108.67±13.19 2.59±0.37 27.63±4.12 20.57±1.76 107.603±11.12 2.07±0.22 44.02±5.57 33.82±4.18 74.71±9.23 21.82±0.98（n＝20） 治疗14 d 45.94±2.30*35.70±2.18*69.97±7.31*23.74±2.18*青藤碱干预组 治疗前 43.67±4.40 34.85±3.46 77.64±5.45 2.75±0.24（n＝20） 治疗14 d 29.42±3.47△▲19.14±1.42△▲109.42±13.42△▲2.14±0.12△▲组别 时间对照组 治疗前（n＝16） 治疗14 d缺血/再灌注组 治疗前

2.2 各组大鼠治疗前后CCR5、β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA水平比较 见表2。对照组大鼠βarrestin 2和β-arrestin 2-mRNA高表达、CCR5低表达，治疗前后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。缺血/再灌注组治疗前后均为β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA低表达、CCR5高表达，与对照组和同组干预前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。青藤碱干预组相反，β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA高表达，CCR5低表达，与缺血/再灌注组和同组干预前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

在肠移植后，随着血管吻合再通，常伴随有缺血/再灌注损伤，研究证实，术后缺血预处理可增强TSOD活性，减少脂质过氧化产物MDA对移植小肠的损害，提高移植小肠存活率［9］。为减轻缺血/再灌注损伤，可在术后进行药物干预，促进移植肠功能恢复。青藤碱是单体生物碱，防己科植物青风藤中提取［10］。具有镇痛、抗炎、免疫抑制等作用，临床用于类风湿性关节炎、关节炎等自身免疫性疾病，对结肠癌、肝癌、肺癌、宫颈癌及炎症性肠病（IBD）等均有治疗作用［11］。

表2 各组大鼠治疗前后CCR5、β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA水平比较（±s）

表2 各组大鼠治疗前后CCR5、β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA水平比较（±s）

组别 时间 β-arrestin 2-mRNA对照组 治疗前 19.43±0.92（n＝16） 治疗21 d 18.52±2.36缺血/再灌注组治疗前 7.82±0.88 CCR5（%） β-arrestin 2（%）8.07±0.49 26.59±1.17 7.63±1.12 27.07±2.19 24.79±2.29 9.87±1.28（n＝20） 治疗21 d 9.77±1.52*27.94±2.38*11.74±2.08*青藤碱干预组 治疗前 22.61±2.35 10.80±1.55 8.15±1.12（n＝20） 治疗21 d 8.45±0.92△▲28.53±1.92△▲23.75±2.18△▲

T-SOD是机体清除氧自由基的一种重要酶，其活性的高低直接反映机体清除氧自由基的能力，并且间接反应组织缺血/再灌注损伤的程度［12-13］。从实验结果来看，缺血/再灌注组T-SOD在治疗前后保持低水平，MDA高水平，与对照组比较有显著差异，说明缺血/再灌注组存在氧化代谢方面异常，氧自由基脂质过氧化反应增强，有严重的组织损害现象。而青藤碱干预组T-SOD明显升高，MDA降低，与缺血/再灌注组和同组干预前有显著差异，说明青藤碱干预性治疗可提高TSOD的活性，减少脂质过氧化产物MDA对移植小肠的损害。NO是由NOS催化L-精氨酸后生成，正常生理性刺激可引起小量NO合成而发挥保护血管内皮、调节血压和传递神经信息等作用。NOS诱导酶通过催化L-精氨酸后生成NO，参与巨噬细胞的非特异性免疫，NO过量合成会对组织造成损伤［14-16］。本实验中，缺血/再灌注组证实了这一现象，NO和NOS高于对照组。青藤碱干预组NO、NOS和MDA则明显降低，提示青藤碱可能参与NOS参与催化L-精氨酸后生成NO的过程，青藤碱可能先抑制NOS的活性，间接降低NO合成，降低其对血管内皮造成的损伤。研究发现，CCR5参与肠道免疫反应，促进肠道Th1细胞分化增殖、参与肠道炎症时的免疫应答，在大鼠结肠炎的实验中，肠黏膜CCR5表达明显上调（阳性表达率提高），CCR5对单核细胞、淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞可能有趋化作用，参与肠黏膜的炎症性损伤［17-18］。而β-arrestin 2是CCR5的上游调控蛋白，可介导受体脱敏与内化，调节CCR5的内化和脱敏过程及蛋白信号转导通路，通过负调节来影响免疫细胞的趋化和免疫应答［19-21］。这在本实验缺血/再灌注组治疗前后均CCR5高表达，β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA低表达。青藤碱可使β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA高表达，CCR5低表达，这一现象提示青藤碱通过调控β-arrestin 2来降低CCR5阳性表达，减轻肠黏膜的Th1细胞介导的免疫应答，降低免疫性损伤，达到降低缺血/再灌注后恢复期炎症损伤，提高小肠移植存活的作用。

综上所述，青藤碱可抑制小肠移植后缺血/再灌注时的脂质过氧化反应、降低脂质过氧化产物MDA对移植小肠的损伤，并通过提高β-arrestin 2和β-arrestin 2-mRNA来降低CCR5，通过这种负调节机制来降低小肠移植后局部炎症反应，对同种异体大鼠小肠移植后缺血/再灌注损伤起到保护作用。

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Protective Effects of Sinomenine on Ischem ia/Reperfusion Injury Follow ing Small Bowel Transp lantation in Rats

ZHOU Li，YANG Shasha，WU Shengying. Taihe Hospital of Hubei University of Medical，Hubei，Shiyan442000，China.

Objective：To observe the effectofsinomenine on ischemia/reperfusion injury in rats following intestinal transplantation，and study its protectivemechanism.M ethods：40 receptor SD rats after smallbowel transplantationwere randomly divided into ischemia/reperfusion group and sinomenine intervention group（n=20），the other 16 SD ratsas the controlgroup.Afteroperation，the sinomenine intervention group was treated with 10%sinomenine［10mL/（kg·d）］for 14 days，and the controlgroup and the ischemia/reperfusion group

Sodium Chloride injection［10mL/（kg·d）］.CCR5 and the expression ofβ-arrestin 2 andβ-arrestin 2-mRNA in intestinalmucosa tissuewere detected with EnVision two stepmethod；NO，NOS，T-SOD and MDA in intestinal tissuewere detected with ELISA Kit.Results：Sinomenine could reduce NO and MDA in intestinal tissue of the rat，increase T-SOD.In the invention group，therewas the high expression ofβ-arrestin 2 andβ-arrestin 2-mRNA in intestinalmucosa tissueand the low expression ofCCR5.Compared with the ischemia/reperfusion group and the same group before intervention，the differencewas statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Sinomenine can inhibit lipid peroxidation after intestinal transplantation and modulate the local immune response after intestinal transplantation by affecting the expression ofbeta-arrestin 2 and CCR5.Ithas protective effects on ischemia/reperfusion injury after allograft transplantation in rats.

Sinomenine；Colon allograft transplantation；CC chemokine receptor 5；β-arrestin 2；Ischemia/reperfusion

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1149-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.006

2017-03-20）

湖北省教育指导项目（B2016125）

△通信作者（电子邮箱：huangminjobhm@163.com）