子痫前期宫内环境导致子代大鼠海马HPA轴相关基因表达改变

胡 蓉 刘学渊 姚晴晴 李笑天

(复旦大学附属妇产科医院产科 上海 200011)

子痫前期宫内环境导致子代大鼠海马HPA轴相关基因表达改变

胡 蓉 刘学渊 姚晴晴 李笑天△

(复旦大学附属妇产科医院产科 上海 200011)

目的 研究子痫前期宫内环境对子代SD大鼠海马下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴相关基因表达的影响。方法 通过给妊娠第14天SD大鼠连续皮下注射亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)至分娩的方法建立子痫前期大鼠动物模型,对照组予生理盐水1 mL皮下注射。用酶联免疫检测(ELISA)方法检测新生子代大鼠血皮质酮(corticosterone,CORT)浓度。用Real-time PCR方法和Western bolt分别检测8周龄子代大鼠海马组织糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)、促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)、CRH受体1 (CRH receptor 1,CRHR1)和IL-6的mRNA水平及其蛋白质水平。结果 与正常子代新生鼠相比,子痫前期子代新生鼠血CORT浓度升高(P<0.05)。与正常子代鼠相比,子痫前期青少年子代鼠海马GR、CRH 和CRHR1 mRNA和蛋白质水平均增加(P<0.05),炎性因子IL-6 mRNA和蛋白质水平均增加(P<0.05)。结论 子痫前期宫内环境影响子代大鼠海马HPA轴相关基因的表达,在子代学习记忆能力受损中起作用。

子痫前期; 子代大鼠; 糖皮质激素受体; CRH; CRHR1; IL-6

子痫前期是妊娠期最常见的以高血压、蛋白尿为主要特征的并发症,国外报道发病率达到7%～10%,我国大约为9.4%。子痫前期对胎儿最重要的影响是慢性宫内缺氧的应激环境,其对子代各脏器结构和功能的程序化影响是多方面的[1-2],其中学习记忆能力和生活质量密切相关。

临床流行病学研究发现,与正常人群子代相比,子痫前期的子代幼年期、青少年期和成年后学习记忆能力下降、IQ平均值较低[2-5]。我们运用子痫前期的大鼠动物模型研究,发现子代鼠青少年期和成年期智力受损、学习记忆和空间定位能力降低[6],伴海马神经干细胞增殖受到抑制[7]。也有研究发现子痫前期的子代鼠表现为大脑缺氧改变、神经元迁移和凋亡的改变。但子痫前期宫内环境导致子代学习记忆能力受损的分子机制尚不清楚。

下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA轴)对海马依赖的学习记忆能力有调控作用,同时受孕期宫内应激环境的程序化影响[8],宫内应激的作用时间、种类和强度的不同,子代可能表现为应激损伤或者对应激的适应性改变,并引起脑内HPA轴相关基因表达的改变。例如胚胎发育期的应激会引起海马糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的过度激活和海马损伤,对HPA轴的负反馈抑制减弱,导致HPA轴过度兴奋,下丘脑分泌更多的促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH),激活垂体产生促肾上腺皮质激素(adrenocortico tropic hormone,ACTH),ACTH作用于肾上腺皮质促进皮质酮(corticoserone,CORT)的生成和分泌,并进一步损伤海马造成恶性循环[9]。CRH过表达的转基因小鼠存在学习记忆缺陷,给予促肾上腺皮质激素释放激素受体(CRHR)拮抗剂能纠正应激引起的记忆障碍以及海马树突丢失[10]。炎性因子白介素-6 (IL-6)在GR受体通路以及大脑缺血缺氧改变的研究中发挥作用,孕期高脂饮食导致子代大脑GR信号通路发生改变,IL-6在其中发挥作用[11]。

因此,我们研究了子痫前期宫内环境对青少年子代大鼠海马HPA轴相关基因GR、CRH和CRHR1表达的影响,和对子代海马炎性因子IL-6表达的影响,以探讨子痫前期宫内环境对子代学习记忆能力影响的分子机制,为出生后干预寻找可能的方向。

材 料 和 方 法

动物实验 清洁级雌性SD大鼠8只(斯莱克实验动物有限公司),体质量230～260 g,于室温18～20 ℃自由饮食。于发情期与雄性SD大鼠8只合笼饲养,阴栓脱落日定为妊娠第1天,分笼饲养。母鼠随机分为2组。在妊娠第14天开始,实验组每天给予亚硝基左旋精氨酸甲酯(美国Sigma公司) 125 mg/kg,对照组给予生理盐水1 mL皮下注射,每天1次直至分娩。自然分娩后,部分仔鼠以断头法取血,血样以2 000×g/min离心10 min,血清-80 ℃保存。部分仔鼠和母鼠一起饲养,每笼1只母鼠所带仔鼠数目相同。各组仔鼠由母鼠哺乳至21天断奶后,分笼饲养至8周龄(56天)以颈椎脱位法处死,取海马组织置于-80 ℃冰箱保存备用。

酶联免疫检测(ELISA法) 取血清按酶联免疫吸附试验检测试剂盒说明书检测血清CORT。

Real-time PCR检测 细胞总RNA用Trizol常规抽提。逆转录用PrimeScriptTMRT试剂盒(日本TAKARA公司),操作步骤严格按照说明书。real-time PCR 在Applied Biosystems FTC3000HT 荧光定量PCR仪(加拿大Funglyn Biotech公司)上完成。PCR样品总反应体积为25 μL,反应体系包括cDNA模板1 μL、引物各0.8 μL、SYBRgreen mix (2×) 10 μL,ROX (50×) 0.4 μL,ddH2O (灭菌蒸馏水) 7 μL。经95 ℃ 30 s预变性后,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30～34 s循环40个,每个循环结束前LightCycle系统自动检测荧光产物的量,所有循环结束后,绘制融解曲线判断扩增产物的特异性。为排除基因组DNA的污染每个样品均设置相应未经逆转录的模板作为阴性对照。每组实验重复3次,每次各样品均设复孔。利用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 PCR引物序列

Western blot检测 以RIPA裂解组织,4 ℃下10 000×g离心5 min后取上清液。BCA法蛋白质定量后经SDS-PAGE分离,转膜后,用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h,加人对应一抗于4 ℃孵育过夜,以TBST洗涤3次后,加入二抗于室温孵育1 h,再以TBST洗涤3次后,采用ECL试剂曝光显色。应用一抗如下:GR (ab3579,英国Abcam公司)、CRH (ab8901,美国Abcam公司)、CRHR1 (sc-12383,美国Santa Cruz公司),IL-6 (ab9324,英国Abcam公司),内参选用GAPDH (ab-9485,美国Abcam公司)。

结 果

子痫前期宫内环境导致子代新生大鼠HPA轴血清CORT浓度的变化 一氧化氮(nitricoxide,NO)合成减少与子痫前期发病相关。Yallampalli等首次用NO合成抑制剂L-NAME建立子痫前期的大鼠动物模型,本研究同样运用孕鼠皮下注射L-NAME的方法建立模型。ELlSA检测结果显示,与正常子代P0期新生鼠相比,子痫前期子代新生大鼠血清CORT浓度明显升高(P < 0.05,图1)。有研究发现子痫前期的新生儿血浆皮质醇浓度较高[12],而L-NAME的使用可能会导致血清皮质酮含量降低[13],因此子代新生大鼠血清CORT浓度升高,提示了子痫前期宫内环境引起子代高CORT的内环境。

Compared with normal neonatal rats,the serum CORT concentration of neonatal rats with preeclampsia was increased.

图1 子痫前期宫内环境对子代新生大鼠血清CORT浓度的影响

Fig 1 Effect of preeclampsia on serum CORT concentration in neonatal offspring rats

子痫前期宫内环境导致8周龄子代大鼠海马GR、CRH和CRHR1表达的改变 分别取实验组和对照组8周龄的子代鼠(相当于人类青春期的年龄)海马组织,Real-time PCR检测发现,子痫前期8周龄子代大鼠海马GR mRNA的水平增加(P<0.05),CRH和CRHR1 mRNA的水平均增加(P<0.05,图2)。 Western blot检测发现,子痫前期8周龄子代大鼠海马GR、CRH、CRHR1蛋白质水平均增加(P<0.05,图3)。

Compared with normal adolescent offspring,the expression of GR,CRH and CRHR1 mRNA was increased in the hippocampus of adolescent rats with preeclampsia.

图2 子痫前期宫内环境导致8周龄子代大鼠海马GR、CRH和CRHR1 mRNA水平的改变

Fig 2 Effect of preeclampsia on expressions of GR,CRH and CRHR1 mRNA in the hippocampus of 8-week offspring rats

Compared with normal adolescent offspring,the expression of GR,CRH and CRHR1 protein was increased in the hippocampus of adolescent rats with preeclampsia.

图3 子痫前期宫内环境导致8周龄子代大鼠海马GR、CRH和CRHR1蛋白水平的改变

Fig 3 Effect of preeclampsia on expressions of GR,CRH and CRHR1 protein in the hippocampus of 8-week offspring rats

子痫前期宫内环境导致8周龄子代大鼠海马炎性因子IL-6 表达的变化 本研究也检测了GR相关的IL-6的表达,Real-time PCR和Western blot检测,与对照组8周龄子代大鼠相比,子痫前期子代大鼠海马中促炎性因子IL-6 mRNA和蛋白质水平均增加(P< 0.05,图4～5)。

Compared with normal adolescent offspring,the expression of IL-6 mRNA was increased in the hippocampus of adolescent rats with preeclampsia.

图4 子痫前期宫内环境导致8周龄子代大鼠海马炎性因子IL-6 mRNA水平的变化

Fig 4 Effect of preeclampsia on expressions of IL-6 mRNA in the hippocampus of 8-week offspring rats

图5 子痫前期宫内环境导致8周龄子代大鼠海马炎性因子IL-6蛋白水平的变化

讨 论

本研究发现,首先子痫前期子代新生大鼠血清皮质酮浓度升高,其次8周龄子代大鼠海马GR、CRH和CRHR1 mRNA水平均增加,8周龄子代大鼠海马促炎性因子IL-6 mRNA水平也增加。提示子痫前期宫内环境导致子代大鼠出生时血清高皮质酮,以及8周龄海马HPA轴相关基因表达的改变,可能在子代学习记忆能力受损中发挥作用。

子痫前期子代可能处于高糖皮质激素的宫内环境水平,依据:(1)子痫前期的新生儿血浆皮质醇浓度较高[12];(2)胎盘局部11β-HSD2酶可以降解糖皮质激素,作为胎盘屏障,避免胎儿处于高糖皮质激素的环境,子痫前期由于胎盘11β-HSD2酶表达的减少,导致局部的屏障作用受损,胎儿暴露于高糖皮质激素环境中[14];(3)子痫前期孕妇的早产儿,与其他同胎龄儿相比,肺透明膜病变发病率较低。本研究运用子痫前期动物模型,发现子痫前期子代新生大鼠出生后血清皮质酮浓度升高,提示了子痫前期子代存在宫内高糖皮质激素的环境,并可能对HPA轴产生影响。有研究发现子痫前期子代到了青少年期,血浆皮质酮水平也较高,提示子痫前期子代HPA轴活性的过度激活[15]。

宫内应激或其他不良环境会影响子代HPA轴的功能。孕晚期反复遭受社会压力应激的子代,青少年期出现胰岛素抵抗、成年后出现应激时HPA轴过度激活、海马GR和CRH mRNA水平均增加[16-17]。孕期高糖低蛋白饮食导致子代的HPA功能异常和成年后高血压等代谢综合征发病增加[18]。宫内缺氧应激可导致子代鼠HPA轴敏感性的改变和crhr1 DNA CpG岛甲基化的改变[19]。但也有海马GR过表达导致负反馈增强和HPA轴功能减弱的研究结果[20],例如出生后获得充分母爱的仔鼠,遇到应激时GR表达增加,CRH、ACTH和糖皮质激素分泌均减少,表现为HPA轴的负反馈增加,减少应激时HPA轴的反应性[21-22]。本研究发现子痫前期的子代大鼠8周龄时GR、CRH和CRHR1 表达增加,提示8周龄时子代表现为对HPA轴的负反馈抑制减弱和HPA轴的过度激活,进一步可通过CRHR的拮抗剂或激动剂来检测应激状态下HPA轴的功能。

HPA轴与海马依赖的学习记忆能力有关。有研究发现胚胎发育期应激会导致CRH和CRHR过表达[23],给予CRHR拮抗剂能纠正应激引起的记忆障碍以及海马树突丢失[10]。小剂量CRH能增强大鼠的空间学习能力,CRH直接注入大鼠脑可导致神经元长时程突触效应的持续增强,该效应能被CRHR拮抗剂所阻断,提示CRH通过其受体参与调节海马神经元的长时程突触效应,进而影响海马依赖的学习记忆功能。CRH通过CRHRl抑制神经元突起的发育[24],并涉及AC/PKC以及MAPK信号转导通路,有NMDA、AMPA和GABA受体参与[25-26]。因此我们推测子痫前期宫内环境导致子代CRH/CRHR1表达的增加,提示了子痫前期子代HPA轴的过度激活,与出生后学习记忆能力受损有关。

糖皮质激素有促进炎症或者抗炎症的作用,因此本研究也检测了海马中与GR信号转导通路和宫内应激环境改变有关的炎症基因IL-6 的水平[27]。发现子痫前期的8周龄子代大鼠的IL-6 水平增加,提示GR下游的炎症促进因子可能在子痫前期子代学习记忆能力抑制的过程中发挥作用。在神经退行性疾病研究中发现,慢性糖皮质激素高暴露导致海马IL-6、NF-κB和IL-18等水平增加,提示糖皮质激素导致的海马炎症反应与神经退行性改变有关[28]。研究发现,抑郁症人群中糖皮质激素暴露导致血IL-6水平升高与海马体积缩小有关,提示了IL-6在海马神经细胞分化生成异常和神经可塑性的异常中起作用[29]。

目前胎源性成人疾病已成为研究热点,子痫前期是妊娠期最常见的并发症之一,随着围产医学的发展,重度子痫前期围产儿出生率的增加,子痫前期宫内环境对子代的影响深远,包括代谢性疾病发病率的增加等,其中学习记忆能力的影响引起我们的关注。本研究结果初步提示,子痫前期大鼠宫内高糖皮质激素的环境影响了子代的HPA轴的功能,可能在子代学习记忆能力受损中起作用,为出生后干预提供了可能的环节。但本研究未对子代HPA轴应激情况下的功能进行研究,是后续要开展的内容。

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Preeclampsia alters the expression of HPA axis related genes in the hippocampus of offspring rats

HU Rong, LIU Xue-yuan, YAO Qing-qing, LI Xiao-tian△

(DepartmenofObstetrics,Obstetrics&GynecologyHospital,FudanUniversity,Shanghai200011,China)

Objective To explore the effect of preeclampsia on the expression of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis related genes in the hippocampus of adolescent offspring rats. MethodsThe pregnant Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups to be given 125 mg·kg-1·d-1L-NAME or 1 mL pure saline by daily injection from day 14 to delivery.Serum corticosterone (CORT) levels in neonatal offspring rats were detected by ELISA.The mRNA and protein levels of glucocorticoid receptor (GR),corticotropin releasing hormone (CRH),CRH receptor 1 (CRHR1) and IL-6 in the hippocampus of 8-week offspring rats were determined by real-time PCR and Western blot,respectively. Results Compared with normal neonatal rats,the serum CORT concentration of neonatal rats with preeclampsia was increased (P<0.05).Compared with normal adolescent offspring,the levels of GR,CRH and CRHR1 mRNA and protein were increased in the hippocampus of adolescent rats with preeclampsia (P<0.05),accompanied by increased IL-6 mRNA and protein (P<

0.05),as a downstream inflammatory gene of the GR. Conclusions We found that adolescent SD rats exposed to preeclampsia showed alteration in the expression of HPA related genes in the hippocampus,which played a role in the impairment of learning and memory in children.

preeclampsia; offspring rats; glucocorticoid receptor; CRH; CRHR1; IL-6

国家自然科学基金(81571460,81270712)

R714.24+5

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.007

2016-12-06;编辑:沈玲)

△Corresponding author E-mail:xiaotianli555@163.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81571460,81270712).