玄柏爽声颗粒HPLC指纹图谱研究

张琇雯 胡 霜 陈念祖 马 勤 王东蕾 赖永华 黄滔敏△

(1复旦大学附属眼耳鼻喉科医院药剂科 上海 200031; 2复旦大学药学院药理学教研室 上海 201203)

玄柏爽声颗粒HPLC指纹图谱研究

张琇雯1胡 霜2陈念祖1马 勤1王东蕾1赖永华1黄滔敏1△

(1复旦大学附属眼耳鼻喉科医院药剂科 上海 200031;2复旦大学药学院药理学教研室 上海 201203)

目的 建立玄柏爽声颗粒HPLC指纹图谱,为其质量控制提供依据。方法 采用Agilent TC C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) 色谱柱,流动相为甲醇-0.2%乙酸水,0～60 min内进行梯度洗脱;柱温25 ℃,流速1 mL/min,检测波长278 nm。分别对11批样品进行测定,采用“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(2004A版)”建立玄柏爽声颗粒HPLC指纹图谱,并对共有峰进行药材归属和指认。结果 建立了玄柏爽声颗粒HPLC指纹图谱,确定了27个共有峰,11批样品的相似度均在0.9以上。各共有峰均能在对应药材中得到归属。用对照品指认了制剂中5个色谱峰,分别为黄柏碱(11号峰)、甘草苷(22号峰)、安格洛苷C(25号峰)、肉桂酸(26号峰)、哈巴俄苷(27号峰)。结论 该方法简便、准确、重现性好、稳定性好,可作为玄柏爽声颗粒的质量评价方法。

玄柏爽声颗粒; HPLC; 指纹图谱; 质量控制

玄柏爽声颗粒是由复旦大学附属眼耳鼻喉科医院在20世纪60年代末70年代初形成的经验方,因疗效显著而沿用至今,是国内知名的十余种医院内部制剂之一。玄柏爽声颗粒方由玄参、黄柏、山豆根、紫苑、蝉蜕、桔梗、甘草组成,其中,玄参为君药,山豆根为臣药,蜜紫菀为佐药,具有清热滋阴、开音利咽的作用,用于喉炎、声带红肿、咽喉干燥。目前,玄柏爽声颗粒的质量标准采用薄层鉴别的方法,该方法尚未建立反映整体信息的指纹图谱或有效成分含量测定项目,因此有必要进一步建立专属性更强的质控项目以控制药品的质量。

中药指纹图谱具有信息量大、特征性强和整体性等特点,能表征药物的整体信息,是符合中药特色的评价方法,目前在中药质量控制方面得到了广泛认可[1-2]。其中HPLC指纹图谱分析方法由于具有分离效能高、操作简单、分析迅速、重现性好等特点,是目前应用最广泛的指纹图谱技术[3-5]。本文采用HPLC对玄柏爽声颗粒样品进行较为全面的指纹图谱研究,采用“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(2004A版)”进行分析,为该制剂的质量控制提供参考。

材 料 和 方 法

仪器 Agilent1100型高效液相色谱仪(美国惠普公司)包括G1322A Degasser在线脱气、G1311A QuartPump四元泵、G1316A Column柱温箱、G1314A VWD 紫外检测器、惠普色谱工作站及20 μL手动进样系统;Auto ScienceAP-01P型纯净水发生器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);B5500s-MTH 超声波清洗器(上海Branson超声波仪器厂);电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司,Sartorius,d=0.1 mg)。

试剂和药品 黄柏碱对照品(批号:140318,上海康标化学品有限公司);甘草苷对照品(批号:111610-200604,中国药品生物制品检定所);安格洛苷C对照品(批号:151205,上海康标化学品有限公司);哈巴俄苷对照品(批号:111730-200604,中国药品生物制品检定所);肉桂酸对照品(批号:110786-200503,中国药品生物制品检定所)。甲醇(HPLC纯,美国Tedia公司);乙酸(批号:20121009,上海凌峰化学试剂有限公司);玄柏爽声颗粒(SYZ-ZF-061-2005,复旦大学附属眼耳鼻喉科医院委托上海练塘药业有限公司加工,批号:20160401、20160402、20160501、20160502、20160601、20160602、20160603、20160604、20160605、20160606、20160607,8 g/袋)。玄参(批号:1008-200003)、山豆根(批号:120976-200503)、紫菀(批号:120956-200505)、蝉蜕(由上海练塘药业有限公司鉴定及提供,符合国家药典标准)、桔梗(批号:121028-200608)、黄柏(批号:121510-201105)及甘草(批号:120904-201318)对照药材均购于中国药品生物制品检定所。

色谱条件 Agilent TC C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) 色谱柱;流动相为甲醇-0.2%乙酸水,梯度洗脱:0～10 min用2%～10%甲醇;10～40 min用10%～60%甲醇;40～60 min用60%～90%甲醇;柱温25 ℃,流速1 mL/min,检测波长278 nm,进样量20 μL。

对照品溶液配制 精密称取哈巴俄苷、肉桂酸、甘草苷、黄柏碱和安格洛苷C各10 mg,分别置于10 mL容量瓶中。用75%甲醇水溶解,定容至刻度,制成对照品溶液。

供试品溶液配制 精密称取玄柏爽声颗粒1.0 g,置于25 mL的容量瓶中,加入蒸馏水至刻度,超声提取60 min,取适量提取液经0.45 μm微孔滤膜滤过,即得玄柏爽声颗粒供试品溶液。

药材供试品的制备 按玄柏爽声颗粒制剂的处方比例,精密称取玄参、山豆根、紫苑、蝉蜕、桔梗、黄柏及甘草对照药材,研细,按供试品溶液配制项下方法进行处理,得各药材供试品溶液。

结 果

提取方法的选择 我们考察了玄柏爽声颗粒在水及30%、50%、75%、100%乙醇中的提取效果,结果表明随着乙醇浓度的增加,提取出的色谱峰个数逐渐减少;在100%乙醇溶剂中仅提取出2个色谱峰。部分峰在水溶剂中提取效率不是最高,如哈巴俄苷、安格洛苷C、肉桂酸等,在0～75%乙醇溶液中,这部分峰的提取效率随着乙醇浓度的增加而增加,而在100%乙醇中,其提取效率又显著降低,甚至不能提取。因此,综合考虑指纹图谱反映样品的整体性情况,再结合颗粒剂的制作过程(该制剂是由各药材水提成分浓缩喷雾干燥而成,溶化性检查要求可溶颗粒全部溶化,有轻微浑浊),我们选择提取色谱峰个数最多的水作为提取溶剂。

检测波长的选择 玄柏爽声颗粒方中玄参为主药,具有凉血滋阴、泻火解毒的功效,化学成分主要有哈巴俄苷、巴苷元、玄参苷甲、乙等环烯醚萜类和安格洛苷C、肉苁蓉苷D等苯丙素苷类[6-7]。其中,哈巴俄苷、安格洛苷C、肉桂酸是玄参中主要活性成分[8],哈巴俄苷具有抗炎、降压、抗乙肝病毒等作用[9],安格洛苷C具有抑制血小板聚集、保肝等作用[9],而肉桂酸能诱导肿瘤细胞分化[10]。主药各有效成分在278 nm均有适宜的灵敏度。处方中臣药山豆根的主要活性成分为苦参碱、氧化苦参碱等生物碱及高丽槐素等黄酮类[11-12],它们均在短波长处有吸收,在210 nm处对制剂进行进样分析,发现色谱基线飘移严重,且尚有部分信息未显示。同时我们考查了254 nm下样品的色谱情况,发现与278 nm相比,254 nm波长下测到的共有峰数目及主要活性成分的吸收峰面积均有所减少。再综合考虑指纹图谱君臣佐使的原则,选择278 nm作为检测波长,在该条件下色谱峰基线稳定,各吸收峰吸收强,受干扰小。

流动相的选择 在乙腈-0.2%乙酸水溶液体系下,哈巴俄苷峰分裂,甘草苷拖尾;在甲醇-0.2%三乙胺色谱系统中,主要活性成分出峰时间较晚;在甲醇-0.2%乙酸色谱系统中,各色谱峰能较好分离,峰形良好、且出峰较多;流动相中加入10 mmol/L KH2PO4、0.5%三乙胺及磷酸调pH对峰形也无改善作用,故选择甲醇-0.2%乙酸色谱系统作为流动相。

色谱柱的选择 在Agilent TC色谱柱中,色谱柱的分离度高,且色谱峰数多,故选其为本实验的分离柱。

精密度试验 取批号为20160602的玄柏爽声颗粒样品,按照“供试品溶液配制”项下方法制备,按色谱条件项下方法进行测定,重复进样6次,记录色谱图,考察仪器的精密度。结果表明,以26号峰肉桂酸作为参照峰,各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.8%,各色谱峰的相对峰面积的RSD均小于3%,表明仪器精密度良好,符合指纹图谱的技术要求。

重复性试验 取批号为20160602的玄柏爽声颗粒样品,按照“供试品溶液配制”项下方法平行制备供试品溶液6份,按色谱条件项下方法进行测定,记录色谱图,考察方法的重复性。结果表明,以26号峰肉桂酸作为参照峰,各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1%,各色谱峰的相对峰面积的RSD均小于5%,表明该方法重复性良好,符合指纹图谱的技术要求。

稳定性试验 取批号为20160602的玄柏爽声颗粒样品,按照“供试品溶液配制”项下方法制备供试品溶液,按色谱条件项下方法,分别于0、3、6、9、12、24 h进行测定,记录色谱图,考察供试品溶液的稳定性。结果表明,以26号峰肉桂酸作为参照峰,各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1%,各色谱峰的相对峰面积的RSD均小于5%,表明供试品溶液在24 h内稳定,符合指纹图谱的技术要求。

指纹图谱的建立及相似度计算 分别准确吸取11批玄柏爽声颗粒样品的供试品溶液,采用上述色谱条件项下方法测定,记录60 min的HPLC色谱图。采用国家药典委员会“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(2004A版)”分析,将11批玄柏爽声颗粒图谱数据导入,时间窗口设为0.1,经多点校正和数据匹配,以平均数法生成指纹图谱和对照指纹图谱(图1)。相似度计算结果见表1,11批玄柏爽声颗粒的相似度良好,均在0.9以上。

共有峰的标定 选择11批玄柏爽声颗粒指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰,共确定共有峰27个,依次编号为1～27。通过对照品对照,分别指认5个色谱峰,其中11号峰为黄柏碱、22号峰为甘草苷、25号峰为安格洛苷C、26号峰为肉桂酸、27号峰为哈巴俄苷。选取12个主要的共有峰作为特征峰,以面积较大、分离度好且出峰稳定的26号峰肉桂酸作为参照峰(S),统计了12个主要的共有色谱特征峰的相对保留时间和相对峰面积(表2～3)。不同批次制剂的共有特征峰的相对保留时间差别较小,9号和11号共有特征峰的相对峰面积的RSD均大于20%,但由于这两个峰占总峰面积的比例均小于10%,符合指纹图谱的技术要求。

图1 11批玄柏爽声颗粒HPLC指纹图谱及对照指纹图谱(R)

SampleS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11RS110.9810.9780.9560.9630.9460.9750.9730.9720.9640.9640.986S20.98110.970.960.9630.9420.9710.9650.9670.9630.9660.983S30.9780.9710.9430.9520.9330.9820.9820.9780.970.9640.984S40.9560.960.94310.9970.9870.960.9420.9570.9630.9480.98S50.9630.9630.9520.99710.9840.9660.9510.9630.9650.9510.984S60.9460.9420.9330.9870.98410.950.9330.9480.9510.9330.97S70.9750.9710.9820.960.9660.9510.9890.990.9840.9720.992S80.9730.9650.9820.9420.9510.9330.98910.9880.9780.9720.986S90.9720.9670.9780.9570.9630.9480.990.98810.9920.9830.992S100.9640.9630.970.9630.9650.9510.9840.9780.99210.9820.989S110.9640.9660.9640.9480.9510.9330.9720.9720.9830.98210.982R0.9860.9830.9840.980.9840.970.9920.9860.9920.9890.9821

11:Phellodendrine;22:Liquiritin;25:Angoroside C;26:Cinnamic acid;27:Harpagoside.

图2 对照品(A)和玄柏爽声颗粒(B)HPLC图

表3 11批玄柏爽声颗粒各共有特征峰的相对峰面积

玄柏爽声颗粒与原药材指纹图谱相关性 在同一测定条件下,对玄柏爽声颗粒和各原药材的供试品溶液进行色谱测定,通过对共有峰的保留时间、峰形等因素进行考察,以确定玄柏爽声颗粒与各原药材指纹图谱的相关性,找出各共有峰的来源。结果表明,玄柏爽声颗粒的27个共有峰均可以在相应的药材中得到指认,其中,11号峰为黄柏碱来源于黄柏、22号峰为甘草苷来源于甘草、25号峰为安格洛苷C来源于玄参、26号峰为肉桂酸来源于玄参、27号峰为哈巴俄苷来源于玄参(图3、表4)。

A:XuanboShuangshengGranule; b:Periostracum Cicada; c:Platycodon Grandiflorum; d:Liquorice; e:Radix Asteris; f:Cortex Phellodendri; g: SophoraTonkinensis; h: Radix Scrophulariae.

图3 玄柏爽声颗粒指纹图谱中各共有峰归属色谱图

讨 论

本实验建立了玄柏爽声颗粒的指纹图谱,确定了27个共有峰,并指认了其中5个色谱峰。对11批制剂进行了相似度分析,相似度均在0.9以上,符合中药指纹图谱相似度评价的基本要求。通过原药材指纹图谱,我们对制剂中各共有峰进行了归属,可分析出制剂中各色谱峰的药材来源。该方法准确、稳定,可为该制剂的质量控制提供一定的参考。

[1] 李强,杜思邈,张忠亮,等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药,2013,44(22):3095-3104.

[2] 杨方良,张晶,孙国祥,等.中药组方指纹图谱研究方法和思路[J].色谱,2016,34(07):715-725.

[3] 马丽娜,张岩,陶遵威.色谱分析技术在中药指纹图谱研究中的应用[J].药物评价研究,2012,35(1):58-62.

[4] 王晴,王英姿,李友林,等.红鹤方制剂HPLC指纹图谱研究[J].北京中医药大学学报,2016,39(01):40-45.

[5] 孙国祥,闫波,侯志飞,等.中药色谱指纹图谱评价方法研究进展[J].中南药学,2015,13(7):673-681.

[6] 薛刚强,杜婧,潘新艳,等.玄参化学成分研究[J].中药材,2014,37(9):1597-1599.

[7] 谢小艳,夏春森．中药玄参的化学成分及药理研究进展[J].亚太传统医药,2010,6( 5) :121-125.

[8] 刘承伟,毕志明,祝艳斐,等.玄参中4种主要活性成分的HPLC定量分析[J].中国药学杂志,2007,42(21):1614-1616.

[9] 王建华,谢丽华,刘洪宇,等.玄参不同加工品中哈巴俄苷与肉桂酸的HPLC含量测定[J].中国药学杂志,2000,35(06):375-378.

[10] LIU L,HUDGINSWR,SHACK S,etal.Cinnamic acid- a natural product with potential use in cancer intervention[J].IntJCancer,1995,62(3):345-350.

[11] 黄颖,王乃平,陈勇.广西产山豆根HPLC指纹图谱测定[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(14):66-68.

[12] 黄韵诗.高效液相色谱法测定山豆根中高丽槐素的含量[J].中南药学,2008,6 (2):193-195.

HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule

ZHANG Xiu-wen1, HU Shuang2, CHEN Nian-zu1, MA Qin1,WANG Dong-lei1, LAI Yong-hua1, HUANG Tao-min1△

(1DepartmentofPharmacy,EyeandENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China;2DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai201203,China)

Objective To establish the HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule for its quality control. Methods The components were separated on an Agilent TC-C18column (150 mm×4.6 mm,5 μm) at 25 ℃,with a gradient elution in 0-60 min at the flow rate of 1 mL/min using 0.2% acetic acid aqueous solution and methanol as the mobile phase.The detection wavelength was 278 nm.By detecting 11 batches ofXuanboShuangshengGranule,the HPLC fingerprint was established using “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCMs (Version 2004A)”and the common peaks were analyzed and identified in raw herbal material. Results The HPLC fingerprint ofXuanboShuangshengGranule was obtained with similarity all over 0.9.Totally 27 common peaks were confirmed,and each common peak could be found in raw herbal medicines.Based on the reference substances,5 common peaks were identified,including phellodendrine (peak 11),liquiritin (peak 22),angoroside C (peak 25),cinnamic acid (peak 26) and harpagoside (peak 27). Conclusions This method is simple,accurate,repeatable and reliable,which could be applied in the quality control ofXuanboShuangshengGranule.

XuanboShuangshengGranule; HPLC; fingerprint; quality control

R917

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.023

2016-11-08;编辑:王蔚)

△Corresponding author E-mail:taominhuang@139.com