毛葡萄及酿酒皮渣中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量分析

张 劲，黄小云，谢太理，杨 莹，管敬喜，谢林君，成 果

（广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁530007）

毛葡萄及酿酒皮渣中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量分析

张 劲，黄小云，谢太理，杨 莹，管敬喜，谢林君，成 果

（广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁530007）

探索广西野生毛葡萄中功能成分白藜芦醇含量分布，采用高效液相色谱法(HPLC)对毛葡萄果皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及酿酒葡萄皮渣、酿酒葡萄籽中的白藜芦醇和白藜芦醇苷含量进行测定。结果表明，除葡萄汁外，毛葡萄、葡萄酒及酿酒皮渣中均存在不同含量的白藜芦醇和白藜芦醇苷，且相同部位白藜芦醇苷含量均高于白藜芦醇。酿酒皮渣中白藜芦醇及白藜芦醇苷的含量最高，具备工业化提取的经济价值，为毛葡萄酿酒废弃物的综合利用提供了理论依据。

白藜芦醇； 白藜芦醇苷； 毛葡萄； 酿酒皮渣

白藜芦醇（resveratrol，Res）别名芪三酚，化学名为3,4',5-三羟基二苯乙烯，分子式C14H12O3，它是植物体在恶劣环境中或受到病原体侵害时分泌的抗毒素，属于天然活性多酚类物质[1]。白藜芦醇具有抗菌、抗脂质氧化、抗癌、抗血小板凝聚与血管松弛、降低血脂等多种重要的作用，被喻为紫杉醇之后又一绿色抗癌物质[2-3]，在保健食品和医药领域中具有可观的开发前景。白藜芦醇分子中的羟基与葡萄糖结合而形成白藜芦醇苷（Piceid，Pd），又称虎杖苷，白藜芦醇苷和白藜芦醇具有相似的生物活性，在肠道中糖苷酶的作用下分离出白藜芦醇[4-6]。近年来，白藜芦醇在含量分析、工艺提取、药理作用等方面的研究较为广泛[7-9]，而白藜芦醇苷相关研究较少受关注。目前研究发现，葡萄是含有较多白藜芦醇的植物之一，但不同品种的葡萄或同种葡萄不同部位中所含白藜芦醇的含量差异较大，一般酿酒品种葡萄白藜芦醇的含量高于鲜食品种葡萄[10]，葡萄皮中白藜芦醇的含量较高[11]，葡萄籽、葡萄果穗轴、葡萄叶、葡萄果汁、葡萄酒中也发现不同程度的白藜芦醇[12]。

毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd）属于葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis.L）真葡萄亚属（E-uvitis）东亚种群之一，原产于中国，是广西野生葡萄中分布最广、蕴藏量最大的种类[13]。前人研究发现毛葡萄及其干红葡萄酒中总酚、总类黄酮、总花色苷的含量高于欧亚种赤霞珠葡萄与葡萄酒，有较强的清除自由基及铜原子还原能力[14]，中国野生种11个种或36个变种株系浆果葡萄中白藜芦醇含量最高为毛葡萄[15]。葡萄废弃物中白藜芦醇的研究越来越多[16-18]，关于毛葡萄酿酒皮渣中白藜芦醇和白藜芦醇苷的研究少有报道。本实验探索了白藜芦醇和白藜芦醇苷在毛葡萄中的分布情况，探索利用毛葡萄酿酒皮渣提取白藜芦醇和白藜芦醇苷的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

毛葡萄：野生，品种为“野酿2号”，由广西农业科学院生物研究所鉴定，2016年8月采自广西罗城。

毛葡萄及酿酒皮渣：由广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所酿造工艺研究室利用野酿2号毛葡萄按照干红酿造工艺发酵酿造干红葡萄酒，在酒精发酵结束时分离酿酒皮渣（含葡萄籽）。

毛葡萄鲜样：称取1 kg鲜果，分离出果皮、果籽。果肉经匀浆、离心（8000 r/min，10 min），取上清液备用。果皮和果籽分别加液氮粉碎，冷冻干燥（-58℃，24 h）。葡萄皮和葡萄籽干粉备用。

毛葡萄酿酒皮渣：称取1 kg酿酒皮渣，分离出葡萄皮渣与葡萄籽，经60℃热风烘干，粉碎，干粉备用。

试剂：白藜芦醇、白藜芦醇苷（HPLC），Sigma；乙腈（色谱级），Fisher；乙酸乙酯，（分析纯）；甲醇（色谱级），Fisher；水为实验室超纯水。

仪器设备：高效液相色谱仪（LC-20AT），日本岛津；高速离心机（TG16-WS），湖南湘仪；真空冷冻干燥机（Alpha 1-2LDplus），德国Christ；超声波清洗机（XUB25），Grant；电热鼓风干燥箱，上海跃进；旋转蒸发仪（RE-52AA），上海亚荣。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇、白藜芦醇苷的提取

葡萄皮、葡萄籽样品：准确称取经干燥粉碎后的葡萄鲜果分离的葡萄皮、葡萄籽及酿后葡萄皮渣和葡萄籽各1.0000 g，加入10 mL乙酸乙酯，混匀，超声30 min，4℃冰箱中放置48 h，离心取上清液，40℃真空浓缩至干，残留物用甲醇溶解后定容至5 mL，经0.45µm微孔滤膜过滤，取续滤液上机进行HPLC分析。

葡萄汁、葡萄酒样品：离心后的澄清葡萄汁样品及葡萄酒样品经0.45µm微孔滤膜过滤，取续滤液上机进行HPLC分析。

1.2.2 HPLC分析

色谱条件：岛津InertSustainC18(250mm×4.6mm×5 µm)，流动相：乙腈∶水=40∶60（v/v），检测器：UV检测器，流速：0.60 mL/min，波长306 nm,柱温：30℃，进样量：10µL。

标准曲线绘制：准确称取白藜芦醇和白藜芦醇苷标准品适量，用甲醇配制成0.94 mg/mL的白藜芦醇标准母液和0.79 mg/mL的白藜芦醇苷标准母液。取母液，用甲醇配制系列浓度白藜芦醇和白藜芦醇苷混合对照溶液，其中白藜芦醇对照液浓度为0.0094µg/mL、0.047µg/mL、0.094µg/mL、0.47 µg/mL、0.94 µg/mL、4.7 µg/mL、9.4 µg/mL、18.8µg/mL，白藜芦醇苷对照液浓度为0.079µg/mL、0.158 µg/mL、0.79 µg/mL、3.95 µg/mL、7.9 µg/mL、19.75µg/mL、39.5µg/mL、79µg/mL，经0.45µm微孔滤膜过滤，取续滤液10µL在上述的色谱条件下上机进行HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇、白藜芦醇苷线性关系的考察

经HPLC分析，白藜芦醇苷标准品在5.383 min出峰，白藜芦醇标准品在9.204 min时出峰，色谱图见图1。以标准品浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，见图2、图3，标准曲线为：白藜芦醇，Y=146165X+6301.7（µg/mL），R2=0.9999；白藜芦醇苷，Y=61439X+5967.8（µg/mL），R2=0.9998，线性关系良好。

图1 白藜芦醇和白藜芦醇苷标准品HPLC色谱图

图2 白藜芦醇标准曲线

图3 白藜芦醇苷标准曲线

2.2 白藜芦醇和白藜芦醇苷测定结果

根据HPLC分析结果，样品HPLC色谱图见图4，样品中白藜芦醇苷出峰时间为5.4 min左右，白藜芦醇出峰时间为9.2 min左右。根据出峰时间和峰面积用标准曲线计算出各样品中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量，数据结果见表1、表2。

图4 毛葡萄酿酒葡萄皮HPLC色谱图

表1 毛葡萄皮、籽中白藜芦醇及白藜芦醇苷含量

表2 毛葡萄酒、汁中白藜芦醇及白藜芦醇苷含量

结果表明，除葡萄汁外，葡萄酒、葡萄鲜果中葡萄皮、葡萄籽以及酿酒葡萄皮渣、酿酒葡萄籽中均含有白藜芦醇和白藜芦醇苷；毛葡萄酒中存在白藜芦醇和白藜芦醇苷，而葡萄汁中未检出，说明葡萄皮、籽中白藜芦醇及其苷可以通过发酵浸渍转移到葡萄酒中。根据陈雷等[19]的研究，对市售国产的11种红、白葡萄中白藜芦醇进行含量测定，其含量为1.0～92.0µg/100 mL，大部分在1.0～2.0µg/100 mL之间，本实验测定毛葡萄酒中白藜芦醇含量为49.9µg/100 mL，表明广西毛葡萄酒中白藜芦醇的含量高于多数国产市售葡萄酒。对比侯建波等[20]研究，其测定的75种进口红葡萄酒的白藜芦醇苷含量为0.34～5.8 mg/L，本实验测定毛葡萄酒白藜芦醇苷含量为26.767 mg/L，表明广西毛葡萄酒中白藜芦醇苷含量远高于部分进口葡萄酒。

从含量分布上看，毛葡萄不同部位白藜芦醇及其苷的含量差异显著。白藜芦醇含量从高到低为：酿酒葡萄皮渣＞鲜果葡萄皮＞鲜果葡萄籽、酿酒葡萄籽，葡萄籽、酿酒葡萄籽只有微量；白藜芦醇苷含量从高到低为：酿酒皮渣＞鲜果葡萄籽＞鲜果葡萄皮＞酿酒葡萄籽，酿酒葡萄籽只含微量；鲜果中皮、籽含量的差异可能与葡萄不同组织部位间合成白藜芦醇和白藜芦醇苷的能力不同有关；对比酿酒前后，鲜果葡萄籽白藜芦醇苷远高于酿酒葡萄籽，表明白藜芦醇苷容易通过发酵浸渍进入酒体。前人研究发现白藜芦醇主要是在葡萄浆果表皮合成[21]，而果肉中白藜芦醇很少或不存在[22]，与本实验结果一致。白藜芦醇和白藜芦醇苷具有难溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮的理化性质[23]，葡萄酒酒精度约为12%vol，通过发酵浸渍，葡萄皮和籽中一部分的白藜芦醇及其苷可以转移到葡萄酒中，但是酿酒皮渣中的白藜芦醇和白藜芦醇苷含量仍旧很可观。一般酿酒厂在发酵结束后会直接把酿酒皮渣当作垃圾直接丢弃，如果我们能利用酿酒皮渣提取富集白藜芦醇和白藜芦醇苷，不仅能变废为宝还避免了对环境造成污染。本实验研究为毛葡萄酿酒废弃物的综合利用提供了理论依据。

2.3 精密度实验

精密称取毛葡萄皮粉1.0000 g，各平行7次，按照样品提取方法处理，测定含量，结果表明，葡萄皮中白藜芦醇平均含量为13.411µg/g，RSD为1.378%，白藜芦醇苷平均含量为20.859µg/g，RSD为4.610%，表明实验的提取和测定方法精密度良好。

2.4 稳定性实验

精密称取毛葡萄皮粉1.0000 g，按照样品提取方法处理，在0～12 h内每隔1 h测定1次含量，结果表明，在12 h内葡萄皮内的白藜芦醇和白藜芦醇苷峰面积无明显变化，13次样品测定，白藜芦醇平均含量为13.250µg/g，RSD为2.160%，白藜芦醇苷平均含量为21.004µg/g，RSD为2.833%，表明样品提取白藜芦醇和白藜芦醇苷的测定稳定性良好。

2.5 回收率实验

精密称取9份各1.0000 g毛葡萄皮干粉，分为3组平行，每组分别加入79µg/mL的白藜芦醇苷标液各0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL和94µg/mL的白藜芦醇标液各0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL，每组平行3份，按照样品提取和测定方法实验，结果表明，9次实验白藜芦醇苷平均回收率为102.040%，RSD为3.080%，白藜芦醇平均回收率为99.316%，RSD为4.710%，表明本实验方法回收率良好，可以满足分析要求。

3 结论

本研究采用HPLC法测定了广西毛葡萄中葡萄皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒以及酿酒葡萄皮渣、酿酒葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量。葡萄汁中未检测出白藜芦醇及其苷，其余样品均检测到不同含量的白藜芦醇及其苷。葡萄酒中白藜芦醇和白藜芦醇苷能通过发酵浸渍进入葡萄酒中，葡萄酿酒皮渣中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量最高，具备富集利用价值，为利用毛葡萄酿酒皮渣提取白藜芦醇和白藜芦醇苷的可行性提供了理论依据。

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Detection of Resveratrol and Piceid Conent in Vitis quinquangularis Rehd and Its Skin Residues

ZHANG Jin,HUANG Xiaoyun,XIE Taili,YANG Ying,GUAN Jingxi,XIE Linjun and CHENG Guo
(Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultrual Sciences,Nanning,Guangxi 530007,China)

In this study,the distribution of functional components in Vitis quinquangularis Rehd including resveratrol and piceid was explored.HPLC was applied to determine resveratrol and piceid content in Vitis quinquangularis Rehd skin,seed,juice,wine and skin residues.The results showed that,resveratrol and piceid existed in Vitis quinquangularis Rehd skin,seed,wine and skin residues,but not in grape juice;piceid content was higher than resveratrol content in the same part;and the content of resveratrol and picid was the highest in skin residues,which was of high value for industrialized extraction.This study provided theoretical base for comprehensive utilization of Vitis quinquangularis Rehd pomace.

resveratrol;piceid;Vitis quinquangularis Rehd;skin residues

TS262.6；TS261.2；TS261.9

：A

1001-9286（2017）08-0124-04

10.13746/j.njkj.2017039

广西农业科学院基本科研业务专项（桂农科2015YM05、桂农科2015YT85、桂农科2015JZ154和桂农科2015JZ150）。

2017-02-28

张劲（1986-），男，助理研究员，硕士，研究方向为农产品加工及贮藏，E-mail：86562900@qq.com。

成果（1987-），女，助理研究员，博士，研究方向为酿酒葡萄生理代谢，E-mail：berry713@163.com。

优先数字出版时间：2017-03-27；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170327.1510.005.html。