14个辣椒杂交种纯度鉴定的SSR引物筛选

杜培粉

（湖南湘研种业有限公司，长沙，410100）

14个辣椒杂交种纯度鉴定的SSR引物筛选

杜培粉

（湖南湘研种业有限公司，长沙，410100）

利用73对多态性较好的辣椒SSR引物，对湘研种业的14个辣椒品种进行差异性筛选，结果表明，每个品种都有1对以上SSR引物可将其父本、母本及F1代区分开；同时对每个品种的多个批次进行验证，检测结果与田间检测结果基本相符。因此，可利用SSR分子标记技术进行辣椒种子室内纯度鉴定，且具有简单、快速、准确、重复性好等优点，SSR分子标记在辣椒种子室内纯度快速检测方面具有很大的应用前景。

辣椒；SSR标记；纯度鉴定

辣椒（Capsicum annuumL.）属茄科辣椒属，原产中南美洲，在温带地区为一年生植物，是我国主要的蔬菜，也是重要的调味品，其栽培面积在我国蔬菜作物中位居第二。辣椒营养丰富，维生素C含量在蔬菜中居首位，还含有丰富的辣椒碱、辣椒素、胡萝卜素、柠檬酸、茄碱等有益物质，具有增强食欲、帮助消化、增强人体抵抗力、抵御多种疾病的作用。在植物育种和种子生产的过程中，F1代杂交种的纯度鉴定工作是种子质量控制的一个重要环节，随着育种进程的加快，辣椒品种越来越多，对优质杂交种的种类和需求量日益增加，使辣椒杂交种质量鉴定研究工作显得极其重要。

SSR标记也称微卫星 DNA（Microsatellite DNA），是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。与其他分子标记（AFLP、RAPD、RFLP等）相比，SSR标记具有以下优点：①多态性高，覆盖整个基因组；②具有多等位基因的特性，提供的信息量高；③以孟德尔方式遗传，通常呈共显性标记，具有很好的稳定性，可以鉴别纯合体和杂合体；④所需DNA量少等。SSR标记技术广泛应用于遗传多样性的研究、亲缘关系的研究以及构建遗传连锁图谱和基因定位。

近年来，利用SSR标记技术进行杂交种纯度鉴定在玉米、棉花等作物上[1～3]均有报道，但辣椒上很少见。利用SSR标记技术，筛选出适合14个杂交种室内纯度鉴定的SSR引物，初步建立了辣椒杂交种种子室内纯度鉴定的SSR体系。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用的14个辣椒品种全部来自湖南湘研种业有限公司，是2014年秋季制种。试验于2015年进行。每个品种取100粒种子，均匀播在发芽盒中，于恒温箱中30℃放置8 d，待长出第一片真叶时进行试验。

1.2 方法

①辣椒总DNA的提取 取发芽一周的杂交种及其父母本的幼苗，参照CTAB法提取DNA[4]，由于纯度鉴定的样本量较多，为提高工作效率，且保证DNA质量，将CTAB法进行简化，在转换离心管时直接转到96孔板中，这样得到的DNA不仅浓度足够高，且纯度也很高，保证了下一步试验准确、方便、快速进行。

②PCR反应10 μL反应体系 10×PCR Buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，引物0.3 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U 0.1 μL，用无菌水补充到10 μL。反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，35个循环；72℃延伸10 min，10℃保存。

③电泳检测PCR反应产物 利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（220 V，60 min），检测PCR扩增产物，电泳完成后，利用银染色法，观察记录，找出父母本间有差异的条带，重复性好，且扩增条带清晰的SSR引物，用于杂交种纯度鉴定。

图1 14个辣椒品种SSR引物筛选电泳图

2 结果与分析

2.1 SSR引物的筛选

利用SSR分子技术进行纯度检测，首先要筛选出父母本带型互补的特征引物，且带型清晰、差异明显。本试验用73对SSR引物（由上海英潍捷基生物公司合成），对14个杂交种及其父母本进行PCR扩增，每个品种都有一对以上的特征引物可用，这些特征引物能清晰地将相应的杂交种及其父母本区分开（图1），并可鉴定出其他的混杂品种。从试验结果可以看出，CA-336-2和CA-644-5分别可以鉴定5个杂交种，CA-117-6可以鉴定3个杂交种，CA-864-1、CA-089-3和CA647-2可以鉴定3个杂交种（表1），所用引物序列见表2。

2.2 杂交种的纯度鉴定

利用筛选到的特征性引物，对公司制的批量种子进行纯度鉴定，提取杂交种及其相应的亲本 DNA进行 SSR分析，经电泳、染色、读带。图2中母本条带清晰可见，说明杂交种中有未授上粉的母本，图3未发现杂带，图4中出现了不同于亲本及杂交种的带型，认为是异品种，统计的室内分子纯度结果与田间纯度鉴定结果相比较，结果基本吻合（表3）。这说明本试验筛选的SSR引物可用于杂交种的纯度检测，且结果具有可靠性和实用性，可为种子的提前销售提供一定的依据。

3 讨论

表1 试验所用14个品种名称及其纯度鉴定的特征引物

表2 用于室内鉴定较好用的引物序列

分子标记技术已应用于作物种质资源和遗传育种的研究[5，6]，特别是在构建指纹图谱和标记目的性状基因方面取得了进展。杨娟等[7]将SSR标记和SCAR标记结合起来，建立多重PCR技术，进行辣椒恢复基因及其等位基因纯合状态的选择，显著提高了辣椒雄性不育三系的选择效率。但多数分子标记方法所需的试验成本较高、技术难度大、或稳定性差，只能适用于相关的科学研究，很难在种子企业推广。本研究采用简化的CTAB法，解决了大批量提取DNA的问题，既节省了费用，又保证了DNA质量，缩短了纯度检测的时间。目前，分子标记育种技术尚不成熟和完善，还不能作为一种育种方法单独使用，辣椒上SSR标记的研究刚起步，已经开发的SSR标记较少[8]，随着更多辣椒SSR位点的开发及研究应用，将进一步推动SSR标记在种子纯度检验、遗传育种及其他研究领域中的应用。而我国传统育种经验丰富，将分子标记这一先进技术与育种家的丰富经验相结合，能使分子标记辅助选择发挥其更大的作用。

图2 大果99纯度鉴定电泳图（引物为CA-089-3）

图3 湘研166纯度鉴定电泳图（引物为CA-117-6）

图4 湘研五号纯度鉴定电泳图（引物为CA-864-1）

表3 14个辣椒品种室内纯度与田间纯度比较

[1]盖树鹏，盖伟玲，王日新.6个玉米杂交种种子纯度的SSR鉴定[J].种子，2010，29（7）：44-47.

[2]谢皓，陈学珍，于同泉，等.一种大豆品种纯度鉴定方法与程序的建立[J].种子，2007，26（9）：104-107.

[3]朱美霞，李英芝，王建书，等.利用SSR方法鉴定棉花品种纯度[J].安徽农业科学，2005，33（11）：2 010-2 016.

[4]王灏，王道杰，谭小力，等.用于RAPD分析的油菜总DNA的快速提取[J].西北农业学报，2001，10（3）：32-34.

[5]罗玉娣，李建国，李明芳.用SSR标记分析辣椒属种质资源的遗传多样性[J].生物技术通报，2006（zl）：337-341.

[6]何建文，杨文鹏.SSR标记技术在辣椒遗传育种中的应用[J].种子，2008，27（11）：81-83.

[7]杨娟，王雯，沈火林.辣椒恢复基因SSR标记定位及分子标记辅助选择育种[J].中国瓜菜，2010，23（5）：1-5.

[8]Lee J M,Nahm S H,Kim Y M,et al．Characterization and molecular genetic mapping of microsatelliite loci in pepper [J]．Theor Appl Genet,2004,108:619-627．

Screening of SSR Primers for Purity Identification of 14 Hybrid Pepper Cultivars

DU Peifen
(Hunan Xiangyan Seed Industry Co.,Ltd.,Changsha 410100)

By using 73 pairs of pepper SSR primers with better polymorphism,the differerce screening experiment of 14 pepper cultivars from Xiangyan Seed Industry Co.,Ltd.was carried out.The results showed that for each cultivar,there was more than one pair of SSR primers could distinguish their male parent,female parent and F1generation.At the same time,the verification experiment about many batches of each cultivar was also carried out,and the detection results were consistent with the field testing results.Therefore,SSR molecular marker technology could be applied on the indoor seed purity identification of pepper,and it had the advantages of simple,rapid,accurate and reproducible,which had a wide application prospect in the rapid detection of indoor purity of pepper seeds.

Pepper;SSR markers;Purity identification

S641.3

A

1001-3547（2017）14-0046-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.14.017

杜培粉，女，硕士，助理研究员，主要从事辣椒新品种选育及分子标记辅助育种，电话：0731-82791257，

E-mail：251222713@qq.com

2017-06-13