钙反应性反式激活因子在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠中的表达及意义

卢 强 陈燕春 刘永新 接琳琳 王巧真 杜红梅 宋 妍 侯 琛 周风华

(潍坊医学院病理学教研室,山东 潍坊 261053)

钙反应性反式激活因子在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠中的表达及意义

卢 强 陈燕春1刘永新1接琳琳1王巧真2杜红梅1宋 妍 侯 琛 周风华

(潍坊医学院病理学教研室,山东 潍坊 261053)

目的探讨钙反应性反式激活因子(CREST)在肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因鼠脊髓及脑干组织中的表达变化及相关性作用。方法分别取出生后95 d、108 d、122 d(早、中、晚期)野生型与SOD1-G93A转基因鼠，通过RT-PCR、蛋白免疫印迹技术检测脊髓组织中CREST mRNA及蛋白水平表达变化，通过免疫荧光双标记技术检测脊髓及脑干组织中CREST的表达变化及与神经元及星形胶质细胞的共表达情况。结果①与野生型鼠相比较，SOD1-G93A转基因鼠脊髓组织中CREST蛋白水平下调(P<0.05)，在mRNA水平变化并不明显。②免疫荧光双标检测显示，CREST主要表达于细胞核，与神经元有共表达，与星形胶质细胞不存在共表达；与野生型鼠比较，SOD1-G93A转基因鼠脊髓和脑干组织中CREST表达下调(P<0.05)。结论CREST的差异表达可能与ALS运动神经元的功能障碍有关。

钙反应性反式激活因子；肌萎缩侧索硬化症

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种以运动神经元进行性变性为主要病变特点的慢性神经退行性疾病，主要累及脊髓、脑干〔1〕。ALS发病与谷氨酸兴奋性毒性、炎症及细胞凋亡等多种机制有关，但具体机制目前尚未明确〔2〕。研究发现，在ALS发病过程中存在突触结构及功能的异常，而神经元内蛋白的异常聚集会导致树突棘密度减少而引起突触异常，从而导致神经元功能障碍〔3〕。钙反应性反式激活因子(CREST)是一种反式激活因子，在正常神经元树突的生长过程中是必需的，在培养的大鼠胚胎皮层神经元中，能够抑制树突的生长和促进其分支发育〔4〕。本实验拟探讨CREST在ALS发病中的作用。

1 材料与方法

1.1动物及标本 野生型及突变型SOD1-G93A转基因小鼠由美国Jackson Laboratories提供。转基因鼠饲养、合笼及子代鼠鉴定按照吴欣等〔5〕方法进行。分别于ALS 转基因鼠发病不同时间点(95 d，108 d，122 d)取材，以同窝野生型鼠作为对照，提取脊髓总RNA、蛋白，并制备脊髓及脑干组织冰冻切片〔6〕。

1.2主要试剂 兔抗CREST多克隆抗体 (1∶100，武汉三鹰)，鸡抗β-tubulinⅢ(1∶100，R&D)多克隆抗体，鸡抗胶原纤维酸性蛋白(GFAP，1∶400，Abcam)多克隆抗体，Alexa Fluor-488标记的驴抗鸡IgY、Cy3标记的羊抗兔IgG(美国Jackson Immuno Research Laboratoris)，OligdT、5×逆转录Buffer、M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)，Taq PCR Master Mix (2×)(北京天根生化科技有限公司)，TRIzol(Life Technologies)。

1.3RT-PCR TRIzol一步法提取脊髓RNA并反转录合成cDNA〔5〕。以β-actin为内参，反应体系： 2×PCR mix 10 μl，CREST上下游引物各1 μl，β-actin上下游引物各0.6 μl，cDNA 1 μl，灭菌双蒸水补齐至20 μl，循环条件：开始94℃ 3 min，然后94℃ 30 s，57℃30 s和72℃30 s，共30个循环，最后72℃5 min，冷却至4℃备用，琼脂糖凝胶电泳并拍照。CREST上游引物：5′CCACCTCCATGAGCATCTCT3′，下游引物：5′TGGTCCGAGACACGTAGTTG3′ (扩增片段长度108 bp)；β-actin上游引物：5′ CGTTGACATCCGTAAAGACC3′，下游引物：5′ ACAGTCCGCCTAGAAGCAC 3′ (扩增片段长度280 bp)。

1.4免疫印迹〔6〕应用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分离蛋白样品，按120 μg蛋白/每孔上样。兔抗CREST抗体(1∶1 000)和小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(1∶2 000)，4℃孵育过夜；HRP标记的相应二抗常温孵育2 h。化学增强发光法(ECL)化学发光，暗室曝光。

1.5免疫荧光双标记〔6〕将处理好的脊髓及脑干组织制备冰冻切片，厚10 μm，室温下晾干后行免疫荧光双标记染色。一抗为兔抗CREST抗体(1∶100)分别与鸡抗β-tubulinⅢ(1∶100)及鸡抗GFAP(1∶400)混合液。

1.6统计学方法 采用图像分析软件IPP5.1检测图片累积光密度及阳性细胞IOD值。使用SPSS20.0软件行t检验。

2 结 果

2.1CREST蛋白及mRNA水平在脊髓组织中的表达变化 蛋白免疫印迹结果显示，与同一时间点野生型鼠(95 d：2.48±0.098，108 d：2.63±0.085,122 d:2.51±0.072)相比，ALS鼠脊髓组织中CREST在蛋白水平表达下调(95 d:1.32±0.081,108 d:1.34±0.045,122 d:1.25±0.070;P<0.05)。RT-PCR结果显示，与同一时间点野生型鼠(95 d：0.49±0.046，108 d:0.47±0.045,122 d:0.50±0.050)相比，ALS鼠脊髓组织中CREST mRNA水平变化并不明显(95 d:0.46±0.010,108 d:0.48±0.036,122 d:0.46±0.053;P>0.05)。见图1。

2.2CREST免疫荧光双标记检测 见图2。CREST主要表达于细胞核。在脊髓组织中，CREST阳性细胞位于脊髓灰质，尤其见于退行性变较明显的脊髓前角；在脑干组织中多个部位均可查见阳性细胞，在舌下神经核、面神经核以及红核(RMC)有差异表达，在脊髓及脑干各部位，CREST均与神经元有共表达，与星形胶质细胞不存在共表达。与野生型鼠比较，ALS鼠中CREST表达下调(P<0.05)。

GM：脊髓前角，7N：面神经核，12N：舌下神经核，标尺=20 μm图2 CREST与β-tubulinⅢ在ALS转基因鼠122 d脊髓前角及脑干神经核团的免疫荧光双标记

3 讨 论

ALS是一种致死性的慢性神经退行性疾病，由于大脑皮层、脑干及脊髓运动神经元的变性导致了进行性肌肉麻痹〔7〕，在ALS发病中脑干的舌下神经核、面神经核及RMC的退变明显，主要症状表现为吞咽困难和构音障碍，脊髓发病型由脊髓前角的运动神经元变性引起，主要症状表现为肢体肌肉的进行性麻痹。CREST是一种SYT相关核蛋白〔8〕，结构上包括3个功能域：①C-末端的转录活性域介导钙诱导的反式激活〔9〕；②N-末端能够抑制基础状态的转录活性；③中间是富含甲硫氨酸的一个多功能结构域，与蛋白质的二聚化、转录活性的调节以及蛋白的亚细胞定位有关〔10〕。 研究发现，CREST对于神经系统的发育是非常重要的，对于维持正常神经元树突的生长过程是必需的，在培养的大鼠胚胎皮层神经元中，能够抑制树突的生长和促进其分支的发育〔4〕，缺乏CREST的小鼠神经元树突的生长和分枝明显减少，并且大多数小鼠出生后会死亡〔8〕。本文发现ALS鼠CREST蛋白水平表达下调，提示CREST蛋白与ALS的发生发展有一定关系，并且CREST的异常表达可能与神经元的功能异常有关。

1Lemarchant S，Pomeshchik Y，Kidin I，etal.ADAMTS-4 promotes neurodegeneration in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Neurodegener，2016;11(1)：10.

2Nanou A，Higginbottom A，Valori CF，etal.Viral delivery of antioxidant genes as a therapeutic strategy in experimental models of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Ther，2013;21(8)：1486-96.

3Gorrie GH，Fecto F，Radzicki D，etal.Dendritic spinopathy in transgenic mice expressing ALS/dementia-linked mutant UBQLN2〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2014;111(40)：14524-9.

4Pradhan A，Liu Y.A multifunctional domain of the calcium-responsive transactivator (CREST)that inhibits dendritic growth in cultured neurons〔J〕.J Biol Chem，2005;280(26)：24738-43.

5吴 欣，管英俊，于 丽，等.Wnt抑制因子-1在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因小鼠中的表达变化〔J〕，解剖学报，2011;42(5)：588-93.

6陈燕春，刘焕彩，管英俊，等.Akt在肌萎缩性脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化及意义〔J〕.解剖学杂志，2014；30(3)：331-4.

7Al-Chalabi A，Jones A，Troakes C，etal.The genetics and neuropathology of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Acta Neuropathol，2012；124(3)：339-52.

8Aizawa H，Hu SC，Bobb K，etal.Dendrite development regulated by CREST，a calcium-regulated transcriptional activator〔J〕.Science，2004；303(5655)：197-202.

9Valero T，Moschopoulou G，Kintzios S，etal.Studies on neuronal differentiation and signalling processes with a novel impedimetric biosensor〔J〕.Biosens Bioelectron，2010；26(14)：1407-13.

10Iukharsky MS,Quintiero A,Matsumoto T,etal.Calcium-responsive transactivator (CREST)protein shares a set of structural and functional traits with other proteins associated with amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Neurodegener，2015；10(1)：20.

〔2016-02-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

Expressionofcalcium-responsivetransactivatorinALStransgenicmice

LUQiang,CHENYan-Chun,LIUYong-Xin,etal.

DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,Shandong,China

ObjectiveTo investigate the expression of calcium-responsive transactivator (CREST) in the spinal cord and brainstem of ALS transgenic mice,and explore the role and significance of CREST in the pathogenesis of ALS.MethodsThe mRNA and protein level of CREST were detected by RT-PCR and Western blot in the spinal cord of ALS transgenic mice at the different stages of disease (post-natal 95 d,108 d and 122 d). The immunofluorescence was used to detect the coexpression of CREST/β-tubulinIII and CREST/GFAP in the spinal cord and brain stem.ResultsCompared with that of wild type mice,the protein level of CREST in the spinal cord tissue was down-regulated (P<0.05),but not significant at mRNA level. CREST was mainly expressed in the nucleus. CREST-positive cells were also β-tubulinIII positive but GFAP negative. Compared with that of wild-type mice,CREST level of SOD1-G93A transgenic mice in the spinal cord and brain stem was down-regulated (P<0.05).ConclusionsThe differential expression of CREST may be related to the dysfunction of motor neurons in ALS.

Calcium-responsive transactivator; ALS

国家自然科学基金青年基金(81271413，81401066)；山东省科技发展计划项目(2012GSF11827)；山东省自然科学基金(ZR2012HQ021)；山东省教育厅课题(J12LK51，J13LK05)；山东省医药卫生科技发展计划项目(2013WS0279)

周风华(1977-)，女，副教授，硕士，主要从事神经发育与神经退行性疾病相关研究。

卢 强(1988-)，男，在读硕士，主要从事神经发育与神经退行性疾病相关研究。

R744.8

A

1005-9202(2017)17-4177-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.004

1 潍坊医学院组织学与胚胎学教研室

2 潍坊医学院人体解剖学教研室