VEGFR-2分子探针超声分子成像评价小鼠下肢缺血性血管新生的可行性

赵 璇 纪伟英

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院(武汉市妇幼保健院)，湖北 武汉 430100)

VEGFR-2分子探针超声分子成像评价小鼠下肢缺血性血管新生的可行性

赵 璇 纪伟英

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院(武汉市妇幼保健院)，湖北 武汉 430100)

目的探讨血管内皮细生长因子受体(VEGFR)-2分子探针的超声分子成像评价小鼠下肢缺血性血管新生可行性。方法将10只实验小鼠麻醉后结扎一侧下肢股动脉制备下肢缺血模型，术后第7天，所有小鼠随机经尾静脉注入携抗小鼠VEGFR-2靶向微泡(MbVEGFR-2)和携同型抗体对照微泡(Mbc)，并行超声分子检查，测量双下肢的显影强度(VI)值，并处死小鼠后对骨骼肌进行免疫组化检查。结果经过8 min循环时间后，MbVEGFR-2组小鼠可见明显的超声显影，Mbc组小鼠可见轻度超声显影，但其显影强度明显弱于MbVEGFR-2组；在非缺血小鼠下肢，经过8 min循环时间后，MbVEGFR-2组和Mbc组小鼠均未见明显的超声显影；缺血下肢实验小鼠MbVEGFR-2的VI值明显高于Mbc和非缺血下肢实验小鼠(P<0.01)，缺血下肢实验小鼠Mbc的VI值高于非缺血下肢实验小鼠(P<0.05)，非缺血下肢骨骼肌VI值在MbVEGFR-2和Mbc之间差异无统计学意义(P>0.05)；DAB染色结果显示下肢缺血小鼠骨骼肌血管有VEGFR-2表达，而下肢非缺血小鼠骨骼肌血管中未见VEGFR-2表达。结论采用携VEGFR-2分子探针的超声成像对缺血下肢新血管进行造影可行，为评价缺血性血管新生提供了病理学依据。

血管内皮生长因子受体-2；超声；分子成像；血管新生

血管新生是缺血性疾病血管阻塞后改善机体自身恢复血流灌溉的重要机制〔1〕，通过无创的分子影像技术对新生血管的早期有效评价对于指导临床缺血性心血管疾病的治疗及疗效评价具有重要意义。研究发现，血管内皮细生长因子受体(VEGFR)-2作为分子靶点的超声分子显影技术已在评价肿瘤组织血管新生领域得到成功应用〔2〕，但利用VEGFR-2分子探针的超声显影技术在评价缺血性血管新生方面鲜有报道。本研究通过建立小鼠下肢缺血模型，探讨利用VEGFR-2分子探针的超声分子成像评价小鼠下肢缺血性血管新生的可行性。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：昆明雌性小鼠(清洁级)10只，10周龄，20～30 g，购自南方医科大学实验动物中心，合格证批号：scXK(粤)2016-015。主要实验仪器：Sequoia 512 超声心动图仪(Siemens，德国)，DAKO Evision免疫组化显色系统和(DAKO，丹麦)。主要实验试剂：二棕榈酰磷脂酰单件(DPPC，Sigma，美国)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin，Avanti，美国)，聚乙二醇(PEG，Applichem，德国)，链亲和素(Streptavidin，Sigma，美国)，普罗沙姆-188(Poloxamer188，BASF，德国)，纯化的大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体(Purified Rat Anti-Mouse VEGFR-2，EB，美国)，生物素化的大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体(Biotin Rat Anti-Mouse VEGFR-2，EB，美国)。

1.2方法

1.2.1VEGFR-2靶向微泡(MbVEGFR-2)和携同型抗体对照微泡(Mbc)的制备 将DPPC、DSPE-PEG2000-Biotin、PEG等脂质材料按照事先确定的比例溶解于一定量的蒸馏水中，同时通入全氟丙烷(C3F8)气体，通过超声振荡形成白色液体得到生物化的脂质微泡。然后将生物化的脂质微泡静置并弃除下清液中纯化的微泡，加入Streptavidin和Purified Rat Anti-Mouse VEGFR-2或同型抗体，制备成携Purified Rat Anti-MouseMbVEGFR-2和Mbc。

1.2.2动物准备 将10只小鼠采用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于鼠板上，于双下肢及腹股沟区域备皮，切开腹股沟区域皮肤，分离出股动脉及其分支，结扎并剪断股动脉及其分支，通过肉眼观察到下肢皮肤发生明显变化时，方可缝合手术切口。

1.2.3超声分子成像 将小鼠采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，然后四肢固定于鼠板上。尾静脉插留置针用于微泡注射，置自制水囊于小鼠双侧下肢上，用自制支架固定超声探头(17L5)于固定的小鼠双侧下肢上，不断调试探头位置以获得良好的下肢显像并保证在整个实验过程中不发生位移。超声分子成像基于二次谐波成像技术，仪器的各项参数：探头发射频率为7.0 MHz，接收频率为14 MHz，机械指数(MI)为0.18，超声发射间隔为10 s。超声分子成像通过尾静脉间隔30 min随机注射MbVEGFR-2和Mbc(约5×107个)。在循环时间达到8 min后获取实验小鼠的第一帧显影图像(组织本地和下肢中滞留微泡)，此后连续超声发射3 s以破坏微泡，10 s后再次获取实验小鼠第二帧图像(组织本地)，实验中所有实验小鼠的超声造影图像存盘，用于数据分析。

1.2.4MCE图像分析 采用MCE图像分析软件(美国Virginia大学)对所获取的超声图像进行分析，测量实验小鼠下肢骨骼肌超声显影的声强度(VI)，并利用彩色编码技术制作下肢骨骼肌显影的彩色编码图像，红色、橙色及白色分别表示显影强度由弱到强变化。

1.2.5免疫组化 超声造影结束后，立刻处死实验小鼠并取双侧骨骼肌，4%多聚甲醛固定。制备冰冻切片，严格按照说明书孵育抗小鼠VEGFR-2以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊大鼠二抗，后行二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木素复染，最后于显微镜下观察并拍照。

1.3统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1超声分子成像检查情况 在缺血小鼠下肢，经过8 min循环时间后，MbVEGFR-2组小鼠可见明显的超声显影，Mbc组小鼠可见轻度超声显影，但其显影强度明显弱于MbVEGFR-2组；在非缺血小鼠下肢，经过8 min循环时间后，MbVEGFR-2组和Mbc组小鼠均未见明显的超声显影。见图1。

图1 缺血和非缺血小鼠下肢超声分子成像

2.2超声VI值分析 缺血下肢实验小鼠MbVEGFR-2的VI值〔(22.57±5.42)U〕明显高于Mbc〔(7.06±1.64)U，P<0.01〕，也明显高于非缺血下肢实验小鼠〔(4.62±1.18)U,P<0.01〕，缺血下肢实验小鼠Mbc的VI值高于非缺血下肢实验小鼠〔(4.85±1.23)U,P<0.05〕，非缺血下肢骨骼肌VI值在MbVEGFR-2和Mbc组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3免疫组化结果 DAB染色结果显示下肢缺血小鼠骨骼肌血管有VEGFR-2表达，棕黄色阳性颗粒大量存在，而下肢非缺血小鼠骨骼肌血管中未见VEGFR-2表达。见图2。

图2 小鼠下肢骨骼肌免疫组化DAB染色结果

3 讨 论

随着人口老龄化的加剧，老年人下肢缺血的发病率呈现上升趋势〔3〕。下肢缺血是由动脉硬化闭塞和血管闭塞性脉管炎引起的，属于常见的血管疾病。当组织出现缺血缺氧时，机体可产生多种细胞因子作用于缺血区域，例如肿瘤坏死因子(TNF)-α、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)-2，血管生成素(Angs)、血管内皮生长因子(VEGF)等促进形成新血管〔4〕，从而使局部缺血缺氧组织供血状况得到改善。研究发现，VEGF可通过与血管内皮细胞上表达的VEGFR-2相结合，导致内皮细胞管道形成，在心血管形成过程中起着至关重要的作用〔5〕。

本研究结果显示，MbVEGFR-2组小鼠可见明显的超声显影，Mbc组小鼠可见轻度超声显影，但其显影强度明显弱于组；在非缺血小鼠下肢，经过8 min循环时间后，MbVEGFR-2组和Mbc组小鼠均未见明显的超声显影，这主要是由于MbVEGFR-2借助于携带的VEGFR-2抗体与下肢缺血处新生血管内皮VEGFR-2相结合，从而在超声检查时出现明显的靶向超声显影，而Mbc携带的同型抗体因无法与新生血管内皮VEGFR-2结合而未出现明显的超声显影〔6〕。在本次研究中Mbc小鼠缺血下肢VI值高于非缺血下肢的VI值，这可能与微泡在新生血管中有一定程度的滞留有关，其可能机制是小鼠下肢缺血的第7天，局部组织处于炎症反应中，脂质微泡可能通过血清补体介导的调理作用及中性粒细胞和巨噬细胞对脂质微泡的“非免疫球蛋白依赖的吞噬作用”，使微泡长时间(30 min)保持完整，从而产生一定程度的“被动靶向显影”〔7〕。本研究通过结扎小鼠下肢股动脉制备下肢缺血缺氧模型，并采用携VEGFR-2分子探针的超声成像对缺血下肢新血管进行造影，此方法可行，并为评价缺血性血管新生提供了病理学依据。

1张梦泽，李国珅，赵欣童，等.血管新生的分子机制与相关疾病〔J〕.中国病理生理杂志，2016；32(9)：1718-22，1728.

2张景瑶，周晓东，罗 文，等.载5-氟尿嘧啶肿瘤靶向超声微泡的制备及其初步评价〔J〕.中国超声医学杂志，2013；29(7)：651-5.

3李维颜，张 毅.介入治疗老年下肢动脉硬化闭塞症患者的疗效〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(21)：5439-40.

4石 慧，王丹彤，乌日嘎等.TNF-α介导的NF-κB信号通路在类风湿性关节炎血管形成中的作用〔J〕.医学综述，2012；18(15)：2397-400.

5Orbay H，Hong H，Koch JM，etal.Pravastatin stimulates angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model：a positron emission tomography imaging study with (64)Cu-NOTA-TRC105〔J〕.Am J Transl Res，2013；6(1)：54-63.

6钟志惟，王 栋，殷香保，等.人源抗VEGFR-2/As2O3-PEG-PLA隐形纳米粒的构建及质量控制研究〔J〕.重庆医学，2016；45(36)：5041-4，5048.

7Lindner JR，Dayton PA，Coggins MP，etal.Noninvasive imaging of inflammation by ultrasound detection of phagocytosed microbubbles〔J〕.Circulation，2000；102(5)：53-8.

〔2017-01-25修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

纪伟英(1962-)，女，主任医师，主要从事妇产科超声研究。

赵 璇(1982-)，女，住院医师，主要从事妇产科超声研究。

R39

A

1005-9202(2017)17-4204-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.015