蝉蜕止咳祛痰平喘有效部位筛选△

江泓，杨炀，陈胡兰，傅超美，邓赟，张梅

(成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137)

·基础研究·

蝉蜕止咳祛痰平喘有效部位筛选△

江泓，杨炀，陈胡兰*，傅超美，邓赟，张梅

(成都中医药大学 药学院，四川 成都611137)

目的：通过研究蝉蜕不同提取部位对小鼠、豚鼠的止咳祛痰平喘作用，对蝉蜕有效部位进行筛选。方法：蝉蜕使用70%乙醇回流提取，所得浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得各部分浸膏，受试动物随机分为对照组、阳性药组及不同提取部位组，采用小鼠氨水引咳法筛选止咳有效部位，小鼠酚红气管段法筛选祛痰有效部位，豚鼠整体药物引喘法筛选出平喘有效部位。结果：与对照组比较，蝉蜕70%乙醇提取物水部位有明显止咳作用(P<0.05)，正丁醇部位有祛痰作用(P<0.01)，乙酸乙酯、水部位具有明显平喘作用(P<0.01)。结论：蝉蜕的止咳有效部位是水部位，祛痰部位为正丁醇部位，平喘部位是乙酸乙酯及水部位。

蝉蜕；止咳；祛痰；平喘；有效部位

蝉蜕是我国民间常用动物药之一，始载于《神农本草经》，被列为中品，称蚱蝉或柞蝉，主小儿惊痫、夜啼、瘨病、寒热，生杨柳之上。根据2015年版《中华人民共和国药典》(《中国药典》)记载，蝉蜕为蝉科昆虫黑蚱CryptotympanapustulataFabricius的若虫羽化时脱落的皮壳，其味甘、性寒，有疏散风热、利咽、透疹、明目退翳、解痉的作用,用于风热感冒、咽痛音哑、麻疹不透、风疹瘙痒、目赤翳障、惊风抽搐、破伤风[1]。《中华临床中药学》谓其能“止咳平喘，主治咳嗽气喘证”[2]。蝉蜕主产于山东等地，在全国大部分地区均有生产[3]。蝉蜕在临床应用历史中被证明具有良好止咳祛痰平喘功效，但此前对其药效学研究多使用水提或醇提的总提取物，未见关于蝉蜕止咳祛痰平喘有效部位的研究。实验分别以小鼠氨水引咳法、酚红气管段法及豚鼠整体药物引喘法考察蝉蜕不同提取部位的止咳、祛痰、平喘作用，为进一步研究工作提供了依据。

1 材料

1.1动物

KM种小鼠，体重18～22g，雌雄兼用；幼年豚鼠，体重200～250g，雌雄兼用，小鼠及豚鼠均购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号为SCXK(川)2014-028。

1.2药物及试剂

蝉蜕购自成都荷花池中药材市场，经成都中医药大学中药鉴定教研室严铸云教授鉴定符合《中华人民共和国药典》标准；咳必清片(国药集团容生制药有限公司，批号：15011412)；氨茶碱注射液(吉林省华牧动物保健品有限公司，批号：150528)；其余试剂均为分析纯。

1.3仪器

RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，FW-100超速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)，YLS-8A多功能诱咳引喘仪(济南益延科技发展有限公司)，721紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

2 方法

2.1药物制备

2.1.1蝉蜕不同提取部位的制备 称取洁净、干燥蝉蜕粉末(过40目筛)200g，于70%乙醇中充分浸泡12h，按3h/次的提取时间加热回流提取3次，提取所用溶剂为药材5倍量，提取液过滤后减压回收溶剂，所得浸膏加水混悬，然后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到石油醚部位(0.04g)、乙酸乙酯部位(1.17g)、正丁醇部位(0.97g)及水部位(1.75g)。

2.1.2蝉蜕水提物制备 称取洁净、干燥蝉蜕粉末(过40目筛)20g，加入200mL水，充分浸泡12h后加热煮沸1h，过滤，再继续分别用100mL水煎煮2次，合并滤液得到蝉蜕水煎液，干燥后得干浸膏0.89g。

2.2蝉蜕止咳祛痰平喘有效部位研究

2.2.1蝉蜕不同提取部位对氨水引咳小鼠的影响 取昆明种小鼠，放入YLS-8A多功能诱咳引喘仪内，恒速、恒量均匀喷入雾化氨水(25%～28%氢氧化铵)5s，喷雾完成后立即取出小鼠，观察小鼠从接受喷雾开始到出现第一次咳嗽的潜伏期及2min内咳嗽次数。在90s内不出现咳嗽的小鼠作为不合格者应舍弃。筛选合格的小鼠，于筛选完成24h后按性别、体重随机分为7组：蝉蜕醇提物石油醚部位组、蝉蜕醇提物乙酸乙酯部位组、蝉蜕醇提物正丁醇部位组、蝉蜕醇提物水部位组、蝉蜕水煎液组、咳必清阳性对照组以及空白对照组(0.9%氯化钠溶液)，每组10只，各组均按0.8g生药·kg-1的剂量灌胃(ig)给药5d，于末次给药1h后，分别将小鼠放入诱咳仪中按前法接受氨水喷雾引咳5s，记录小鼠从接受喷雾引咳开始到出现咳嗽的潜伏期以及2min内的咳嗽次数，观察比较各给药组与对照组之间止咳作用的差异[4]。

2.2.2蝉蜕不同提取部位对小鼠祛痰作用 精密称取酚红1mg，用1mol氢氧化钠和0.9%氯化钠溶液按1∶15比例配制而成的溶液(A液)溶解，将溶液转移至100mL容量瓶中，用A液洗涤烧杯，洗涤液转移至容量瓶中，重复3次，定容，标注为B液，备用。分别精密量取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mL的B液于5mL的容量瓶中，用A液定容，作为酚红标准溶液。将酚红标准溶液以A液为空白，于紫外分光光度计558nm处测定其OD值，每个样品重复测定3次，取平均值。以OD值的平均值(Y)对酚红浓度(X，mg·L-1)进行线性回归，得酚红标准曲线方程：Y=0.3205X+0.0296，r=0.999。

参照文献方法[5-6]加以改进，70只昆明种小鼠随机分为7组：蝉蜕醇提物石油醚部位组、蝉蜕醇提物乙酸乙酯部位组、蝉蜕醇提物正丁醇部位组、蝉蜕醇提物水部位组、蝉蜕水煎液组、氯化铵阳性对照组以及空白对照组(0.9%氯化钠溶液)，每组10只。各组均按0.8g生药·kg-1的剂量ig给药5d，末次给药1h后，小鼠均接受腹腔注射2.5%的酚红0.9%氯化钠溶液0.5mL，于注射酚红后0.5h处死动物，分离气管，用手术线分别在甲状腺软骨下缘处和气管分盆处结扎，自结扎处剪取气管，置于氢氧化钠溶液和0.9%氯化钠溶液按照1∶15的比例配制成的溶液3mL中浸泡过夜。次日，取上清透明红色液体于紫外分光光度计在波长558nm处测定OD值，每个样品重复测定3次，取其平均值，根据酚红标准曲线及小鼠气管质量，计算出小鼠平均每克气管组织酚红分泌量，比较各个给药组与对照组之间祛痰作用的差异。

2.2.3蝉蜕不同提取部位对哮喘豚鼠影响 取体质量200～250g幼年豚鼠，雌雄各半，放入YLS-8A多功能诱咳引喘仪内，以恒速、恒量喷入致喘剂(新制2%氯化乙酰胆碱和0.1%磷酸组胺等体积混合液)30s，观察动物自接受喷雾到出现哮喘状态(以出现喘息性抽搐为判断标准)的潜伏期。哮喘潜伏期在2min内的豚鼠为敏感动物，选择其作为试验动物。于筛选完成24h后将合格豚鼠随机分为蝉蜕醇提物石油醚部位组、蝉蜕醇提物乙酸乙酯部位组、蝉蜕醇提物正丁醇部位组、蝉蜕醇提物水部位组、蝉蜕水煎液组、氨茶碱阳性对照组以及空白对照组(0.9%氯化钠溶液)7组，每组5只。在完成筛选24h后各组均按1g生药·kg-1的剂量ig给药5d。于末次给药1h后按前法重新进行喷雾引喘30s，观察给药后豚鼠产生哮喘潜伏期(潜伏期大于6min者均按360s计算)，比较各给药组平喘作用[7]。

3 结果

3.1蝉蜕不同提取部位对氨水引咳小鼠的影响

蝉蜕水煎液组能明显延长小鼠咳嗽潜伏期，与对照组比较有统计学差异(P<0.05)，水部位、水煎液及咳必清组小鼠2min内咳嗽次数明显减少，与对照组比较，具有统计学差异(P<0.05)，表明蝉蜕水煎液及乙醇提取物对氨水引咳小鼠有治疗作用，见表1。

表1 蝉蜕不同提取部位对小鼠止咳作用的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。

3.2祛痰实验

蝉蜕正丁醇部位和乙酸乙酯部位给药组小鼠气管酚红排泌量明显提高，与对照组相比具有统计学意义(正丁醇P<0.01，乙酸乙酯P<0.05)，提示蝉蜕乙醇提取物正丁醇、乙酸乙酯部位有一定的祛痰作用，见表2。

3.3平喘实验

蝉蜕水煎液及乙醇提取物水、乙酸乙酯部位、氨茶碱给药组能明显延长豚鼠哮喘潜伏期，与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)，表明蝉蜕乙醇提取物中水、乙酸乙酯部位以及蝉蜕水煎液对哮喘豚鼠具有一定缓解作用，其中以水煎液作用最强，见表3。

表2 蝉蜕不同提取部位对小鼠气管酚红排泌量的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表3 蝉蜕不同提取部位对豚鼠哮喘潜伏期的影响

4 讨论

通过对蝉蜕不同提取部位的活性进行筛选实验，为蝉蜕临床发挥止咳祛痰平喘功效提供了一定的科学依据，弥补了此前主要使用蝉蜕水煎液、乙醇总提取物为研究对象对蝉蜕止咳平喘进行药效学研究的不足，在一定程度上明确了蝉蜕止咳平喘物质基础，为对蝉蜕进行深入研究、开发提供了理论依据。实验结果表明，蝉蜕水煎液及乙醇提取后的水部位有良好止咳作用，乙醇提取后的正丁醇部位有一定祛痰作用，水煎剂以及水、乙酸乙酯部位对乙酰胆碱和磷酸组胺引起的哮喘有良好的缓解作用，上述部位为蝉蜕止咳、祛痰、平喘的主要有效部位，蝉蜕止咳祛痰平喘有效部位并不局限于某一特定部位，表明蝉蜕的有效成分不是某单一化合物，其药理作用是由多个部位、多种化合物协同发挥起效。此前对蝉蜕水煎液的止咳祛痰平喘作用曾有研究，发现其有明显止咳祛痰平喘的药理作用[8]，与本实验结果相符，且在本实验中，蝉蜕水煎液药效较其乙醇提取后的各部位更强；在各乙醇提取部位中，属水部位作用较强，而它也是蝉蜕最重要的止咳平喘作用的有效部位，说明蝉蜕止咳平喘有效成分主要为水溶性、大极性成分。根据此前关于蝉蜕化学成分的研究报道，动物药蝉蜕中含有多种复杂大分子化合物，其中包括大量蛋白质类成分，此外还有多种氨基酸、微量元素等成分。作为混合提取物其成分复杂，目前未见对其提取物的止咳平喘活性成分进行系统研究，但在一些针对其他药物的止咳平喘活性成分的研究中发现，某些蛋白质和氨基酸对治疗哮喘和气道高反应有药理活性，具有一定平喘作用[9-10]，这为蝉蜕有效成分的研究提供了灵感，故后续实验将以蝉蜕大分子、蛋白质的分离为主，以期对蝉蜕止咳平喘活性成分进行分离、纯化，并实现对蝉蜕治疗咳嗽和哮喘作用机制的探讨研究。

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Study on Active Fraction of Cicadae Periostracum on Relieving Cough and Asthma

JIANG Hong，YANG Yang，CHEN Hulan*，FU Chaomei，DENG Yun，ZHANG Mei

(School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137,China)

Objective：To compare the cough relieving，sputum reducingand asthma relieving actionsof different of Cicadae Periostracumextracts.Methods：The antitussive，expectorant and anti-asthmatic effects were observed by using cough mice caused by ammonia，tracheal phenol red test and asthma guinea-pigs caused by acetylcholine chloride and histamine phosphate.Results：Water decoction and water fraction showed acough-relieving action.n-butanol fraction exhibited an expectorant effect，and water decoction，ethyl acetate extract and water fraction showed ananti-asthma action.Conclusion：The water fraction is the active part on cough relieving，n-butanol part is the effective part on reducing sputum，and the water fraction and ethyl acetate extractare active parts for relieving asthma.

Cicadae Periostracum；antitussive effect；expectorant effect；anti-asthmatic effect；effective part

四川省科技支撑计划项目(2013SZZ016)；四川省科技厅“中药药效物质基础研究与创新中药发现四川省青年科技创新研究团队”项目(2016TD0006)

] 陈胡兰，博士，教授，研究方向：中药化学；Tel：(028)61800231，E-mail：hlan999@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.011

2016-02-19)

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