侵染芹菜的甜椒内源RNA病毒鉴定及序列分析

赵兴华, 于沛侠, 陈丽君, 王德富, 牛颜冰*

(1. 河南省济源市农牧局园艺工作站,济源459000; 2. 山西农业大学生命科学学院,太谷 030801)

侵染芹菜的甜椒内源RNA病毒鉴定及序列分析

赵兴华1, 于沛侠2, 陈丽君2, 王德富2, 牛颜冰2*

(1. 河南省济源市农牧局园艺工作站,济源459000; 2. 山西农业大学生命科学学院,太谷 030801)

本试验利用双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)提取技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对表现皱缩症状的芹菜进行分子鉴定,发现芹菜被甜椒内源RNA病毒Bellpepperalphaendornavirus(BPEV)所侵染。为进一步明确山西芹菜BPEV分离物(BPEV-QC,GenBank登录号为KY659226)的分类地位,根据SIA测序结果设计BPEV特异性引物进行RT-PCR检测,并进行序列相似性比较和系统进化分析。序列同源性分析表明:BPEV-QC与BPEV分离物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW)的同源性为80.0%～97.8%,与其他内源RNA病毒科分离物的同源性仅为30.6%～37.6%,表明:BPEV-QC与BPEV分离物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj)形成一个独立分支,亲缘关系最近。

芹菜; 病原鉴定; 甜椒内源RNA病毒; 序列分析

芹菜Apiumgraveolens为伞形科植物,具有一定的药用功效。近年来,随着人们生活水平的提高和保健意识的增强,对芹菜的需求量也在不断增加,种植规模不断扩大引起的病毒病危害也愈发普遍,严重影响了芹菜的产量和品质。目前芹菜主要受到黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)[1]、烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)、蚕豆萎蔫病毒Broad bean wilt virus (BBWV)、欧洲防风花叶病毒Parsnipmosaicvirus(ParMV)[2]、芹菜花叶病毒Celerymosaicvirus(CeMV)[3]、苜蓿花叶病毒Alfalfamosaicvirus(AMV)[4]、花生矮化病毒Peanutstuntvirus(PSV)、南芥菜花叶病毒Arabismosaicvirus(ArMV)、草莓潜环斑病毒Strawberrylatentringspotvirus(SLRSV)、番茄不孕病毒Tomatoaspermyvirus(TAV)[5]、芹菜黄花叶病毒Celery yellow mosaic virus (CeYMV)和芜菁花叶病毒Turnipmosaicvirus(TuMV)等病毒的单独或复合侵染。

笔者于2014年9月对山西晋中地区芹菜进行病害调查时,发现许多芹菜植株表现出严重皱缩症状,有的田块病株率甚至高达60%。为明确引起芹菜皱缩症状的病原,本试验利用dsRNA技术[6]和SIA方法[7]对采集的疑似病毒病样品进行分子鉴定,结果发现芹菜受到BPEV侵染,将其命名为BPEV-QC,并对BPEV-QC的部分序列进行了克隆和系统进化分析,明确了其分类地位,这为进一步获得甜椒内源RNA病毒山西芹菜分离物(BPEV-QC)的基因组全序列奠定了一定的基础,也为芹菜病毒病的防治工作提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

表现皱缩症状的芹菜植株叶片病样采自山西太谷韩村(图1)。

图1 芹菜田间发病症状Fig.1 Symptoms of diseased Apium graveolens in the field

1.2 方法

1.2.1 植物病原dsRNA的提取

参照牛颜冰等[8-9]和Tzanetakis等[6]的方法提取表现皱缩症状的芹菜病叶dsRNA。

1.2.2 样品SIA和RT-PCR检测

以提取的病样dsRNA为模板,用XTN269引物反转录获得病毒cDNA,再利用XTN177引物进行SIA检测,反应体系和程序参照牛颜冰等[10]的方法。明确芹菜病毒病原后,根据NCBI上已收录的BPEV分离物保守区设计特异引物对病毒部分序列进行RT-PCR扩增,同时以健康植株为阴性对照。所使用的随机引物序列与特异引物序列见表1。

表1PCR扩增所用引物序列

Table1SequencesofprimerpairsusedforSIAandRT-PCRamplification

引物名称Primername引物序列(5′⁃3′)Primersequence(5′⁃3′)XTN269AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGNNNNNNXTN177AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGBPEV⁃FTGGTCACGAAACGGTATTGABPEV⁃RTTTGTAGCAAGGGGTGCTCT

1.2.3 PCR产物克隆及序列分析

PCR产物纯化回收后进行连接和转化,随机选取3个经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行测序。测序结果利用NCBI中的BLAST检索同源序列;序列相似性采用DNAMAN 6.0软件进行分析;利用MEGA 5.2软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 样品SIA检测结果

以XTN177为引物,以反转录得到的cDNA为模板进行SIA扩增,得到大小为799 bp的片段,而健康样品未扩增出相应大小的条带(图2)。测序结果经BLAST同源性比较发现其与已报道的BPEV分离物的相似性最高,为80.0%～97.8%,初步证明芹菜被BPEV所侵染,并将其命名为BPEV-QC。

图2 芹菜病样SIA扩增产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis of SIA products of diseased Apium graveolens leaves

2.2 样品RT-PCR检测

为进一步确定侵染芹菜的病毒病原,以cDNA为模板,以BPEV-F/BPEV-R为引物进行特异性扩增,获得大小为1 092 bp的目的片段(图3),而健康样品中未扩增出相应大小的片段,说明引起芹菜皱缩症状的病毒为BPEV。

2.3 BPEV-QC与内源RNA病毒科其他分离物的序列相似性

利用DNAMAN 6.0软件对BPEV-QC分离物和其他13个内源RNA病毒科分离物(表2)进行核苷酸序列同源性分析,结果表明分离物BPEV-QC与其他内源RNA病毒分离物的核苷酸同源性在30.6%～97.8%之间,其中与BPEV分离物IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW的同源性较高,在80.0%～97.8%之间,与来自以色列IS的同源性最高,为97.8%,与来自美国的BPEV-YW同源性最低,为80.0%,而与其他内源RNA病毒科分离物同源性比较低,为30.6%～37.6%。

图3 芹菜病样RT-PCR检测结果Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR products of Apium graveolens leaves

表2 BPEV-QC与已报道的13个内源RNA病毒分离物核苷酸同源性比较1)

1) “-”表示未知。 “-” unknown.

2.4 BPEV-QC系统进化分析

为进一步明确BPEV-QC的起源与进化关系,使用MAGE 5.2软件对该分离物和已报道的其他13个来源不同的内源RNA病毒科分离物构建系统进化树(图4)。从系统进化树中可以看出,BPEV-QC与其他BPEV分离物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj)形成一个大的分支,聚为一簇,这进一步说明BPEV-QC属于BPEV分离物。

3 讨论

植物病毒素称植物“癌症”,作为伞形科蔬菜的主要病害之一,常常导致芹菜产量降低和品质变劣。笔者2014年对山西晋中地区芹菜进行病害调查时发现田间病毒病害发生较为普遍,部分田块病株率甚至高达70%。为明确其具体病毒病原,本研究利用双链RNA技术和SIA检测方法对芹菜病株进行了分子鉴定,发现感病芹菜受到甜椒内源RNA病毒的侵染,该结果为芹菜病毒病害的有效防治提供了一定的依据。

内源RNA病毒自第一次从蚕豆中发现以来,其寄主范围在不断扩大,包括植物[11]、真菌[12]和卵菌等。内源RNA病毒的基因组大小在9.8～17.6 kb之间[13-14],能独立于宿主的基因进行复制[15]。内源RNA病毒属Endornavirus是国际病毒分类委员会(ICTV)于2005年7月第八次病毒分类报告中新增的属,其代表种是蚕豆内源RNA病毒[16-17],2012年第九次病毒分类报告中将其升级为内源RNA病毒科Endornaviridae[18],2016年国际病毒分类委员会又将Endornaviridae划分为Alphaendornavirus和Betaendornavirus两个属(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)。甜椒内源RNA病毒是Alphaendornavirus属的一个重要成员，其编码的蛋白从N端到C端依次为病毒的甲基转移酶、解旋酶、UDP-糖基转移酶和依赖RNA的RNA聚合酶[19]。

图4 BPEV-QC与已报道的其他13个内源RNA病毒分离物系统进化树构建Fig.4 Phylogenetic tree of BPEV-QC and other 13 reported Endornaviridae isolates

大多数内源RNA病毒对宿主不引起任何病症[13]。在一般情况下,低拷贝数的内源RNA病毒在植物宿主中依然可以通过种子高速率传播[20-21]。然而,Ikeda等发现HmEV1是植物的弱毒力因子[22]。Osaki等发现VfEV与蚕豆雄性不育相关[23]。现报道的BPEV宿主绝大部分为辣椒,Jo等通过辣椒转录组拼接出BPEV全长和部分片段,同时进行重组分析预测出BPEV-YW在4 852～5 363之间插入了Maor的部分片段[24]。本研究在芹菜上发现了BPEV,是否是由于重组导致侵染芹菜,还需进一步研究。

本研究从具有皱缩症状的芹菜中得到甜椒内源RNA病毒山西芹菜分离物(BPEV-QC),利用部分扩增序列进行了同源性比较和系统进化分析,发现BPEV-QC与BPEV IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW分离物的同源性在80.0%～97.8%之间,而与其他内源RNA病毒科分离物同源性较低,为30.6%～37.6%;系统进化分析表明BPEV-QC与BPEV IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj分离物形成一个独立分支,亲缘关系最近。但本试验的结果是基于BPEV-QC部分序列的比较,无法精确地确立其种属分类地位和变异进化关系,要想获得更全面的基因信息,还需进一步扩增其全长序列,明确其具体的基因组结构,进而研究其致病机理和病害流行规律。

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(责任编辑： 杨明丽)

DetectionandsequenceanalysisofBellpepperalphaendornavirusinfectingApiumgraveolens

Zhao Xinghua1, Yu Peixia2, Chen Lijun2, Wang Defu2, Niu Yanbing2

(1.HorticulturalStationofJiyuanAgriculturalandAnimalHusbandryBureauinHenanProvince,Jiyuan459000,China;2.CollegeofLifeSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Viral pathogen that causedApiumgraveolenswrinkled disease, was identified by double-stranded RNA (dsRNA) extraction and sequence-independent amplification (SIA). The results of SIA and sequencing showed thatA.graveolenswas infected byBellpepperalphaendornavirus(BPEV). To further characterize the BPEV strain fromA.graveolens(BPEV-QC), specific primer pairs were designed for RT-PCR according to the results of SIA.Sequence alignments showed that BPEV-QC shared high homology (80.0%-97.8%) with BPEV isolates (IS, Maor, Kyosuzu, BPEV, lj, BPEV-YW), but shared low homology (30.6%-37.6%) with otherEndornaviridaeisolates, Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of BPEV-QC and otherEndornaviridaeisolates showed that BPEV-QC was most closely related toEndornaviridaeisolates (IS, Maor, Kyosuzu, BPEV, lj), and these isolates formed an independent branch.

Apiumgraveolens; pathogen identification;Bellpepperalphaendornavirus; sequence analysis

研究简报ResearchNotes

S 436.3

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.023

2016-10-25

： 2017-01-10

公益性行业(农业)科研专项(201303028); 国家自然科学基金(31540050)

* 通信作者 E-mail: niuyanbingbest@163.com