HPLC测定美花筋骨草中三种黄酮的含量

张慧，夏厚林，杨孟妮，邓放

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HPLC测定美花筋骨草中三种黄酮的含量

张慧，夏厚林，杨孟妮，邓放

目的：建立同时测定美花筋骨草的三种黄酮含量的方法。方法：采用HPLC测定美花筋骨草中木犀草素、芹菜素和芫花素三种黄酮成分的含量，采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 µm)，以甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱，检测波长350 nm（木犀草素）、340 nm（芹菜素）、336 nm（芫花素）。结果建立了同时测定美花筋骨草的三种黄酮含量的方法，色谱图中三种成分分离度良好，方法学考察符合要求。结论：本方法操作简便，结果准确，重复性好，可靠性好，可用于同时测定美花筋骨草中的三种黄酮含量。

美花筋骨草；梯度洗脱；黄酮；含量测定

美花筋骨草为唇形科筋骨草属植物美花圆叶筋骨草Ajuga ovalifoliaBur.et Franch. var.calantha(Diels)C. Y. Wu et C.Chen的干燥全草，收载于《四川省藏药材标准》2014年版[1]。藏医药经典著作《四部医典》记载：能引黄水、养骨槽[2]；《藏药志》记载：本品具有补髓，接骨，燥黄水的功能。用于治疗浮肿后流黄水、关节积黄水、骨松质发炎、跌打损伤、骨折挫伤、筋骨疼痛和风湿关节痛[3]。课题组前期从美花筋骨草中分离得到木犀草素、芹菜素和芫花素三种黄酮类成分。而《四川省藏药材标准》2014年版美花筋骨草的标准中仅将含量相对较高的木犀草素作为控制其质量的指标成分，不能全面评价美花筋骨草中黄酮类成分的总体情况。

课题组前期用HPLC法，选择不同的流动相分别分离、测定三种黄酮的含量：采用甲醇-0.1%冰乙酸水溶液(80:20)测定芹菜素和芫花素的含量；采用甲醇-0.1%冰乙酸水溶液(70:30)测定木犀草素的含量。上述三种成分须分别进行测定，操作烦琐、费时。因此，拟采用梯度洗脱法同时测定三种黄酮成分的含量，使操作更为简便快捷。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BS124S电子分析天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器，北京有限公司），HPLC高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1200 Series），KQ-600DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

美花筋骨草药材分别采自四川省阿坝州若尔盖县、色达县、红原县，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为唇形科筋骨草属植物美花圆叶筋骨草Ajuga ovalifoliaBur.et Franch. var.calantha(Diels) C. Y.Wu et C.Chen的干燥全草。对照品木犀草素(批号：111520-200504)、芹菜素（批号：111901-201102）、芫花素（批号：111899-201001）均购自中国食品药品检定研究所。甲醇为色谱纯，水为超纯水，实验所用其他试剂均为分析纯。

2 实验部分

2.1 样品制备

2.1.1 混合对照品溶液制备 精密吸取木犀草素，芹菜素，芫花素对照品各适量，加甲醇配制成混合对照品储备液，取适量储备液稀释至每1 mL含木犀草素0.4 mg，含芹菜素0.04 mg，含芫花素0.04 mg。

2.1.2 供试品溶液制备 取本品粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率500W，频率40kHz）1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，过0.45µm微孔滤膜，取续滤液，即得样品溶液。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件 XBridgeTM C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 µm)，甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱(见表1)，检测波长木犀草素350 nm、芹菜素340 nm、芫花素336 nm，流速1.0 mL．min-1，柱温25 ℃。在此条件下美花筋骨草中木犀草素，芹菜素，芫花素与其他组分在22 min内均能达到基线分离(见图1、图2)。

表1 流动相比例表

图1 美花筋骨草对照品HPLC图

图2 美花筋骨草样品HPLC图

2.2.2 线性关系的考察 取‘2.1.1’项下混合对照品溶液，其中木犀草素0.4 mg．mL-1，芹菜素0.04 mg．mL-1，芫花素0.04 mg．mL-1，分别进样2 µL，4 µL，8 µL，12 µL，16 µL，20 µL。以进样量(µg)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表2。结果表明，木犀草素在0.8 µg ～8 µg，芹菜素在0.08 µg ～0.8 µg，芫花素在0.08 µg～0.8 µg，峰面积与进样量有较好的线性关系。

表2 美花筋骨草中3种黄酮成分线性回归方程

2.2.3 精密度考察 精密吸取上述混合对照品溶液，按‘2.2.1’条件重复进样6次测定峰面积，结果对照品中木犀草素、芹菜素、芫花素的RSD分别为1.16%，0.73%，0.64%，表明方法精密度良好。

2.2.4 稳定性考察 精密吸取‘2.1.2’中供试液溶液20µL，按‘2.2.1’条件分别于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h进样测定峰面积，结果样品中木犀草素、芹菜素、芫花素的RSD分别为2.05%，2.33%，2.86%，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.2.5 重复性考察 取本品粉末6份，各约1.0 g，精密称定，制备成供试品溶液，按按‘2.2.1’条件进行测定，结果木犀草素、芹菜素、芫花素的RSD分别为1.83%，1.70%，2.04%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率考察 精密称定已知含量的药材粉末0.5 g共6份，精密加入适量木犀草素、芹菜素、芫花素对照品按供试品溶液制备及测定法操作，进行色谱分析，结果木犀草素、芹菜素、芫花素平均回收率分别为93.59%，98.91%，92.81%，RSD分别为2.95%，2.00%，2.31%，符合方法学要求。

2.3 样品测定

准确吸取‘2.1’项下混合对照品溶液和供试品溶液各20 µL, 注入液相色谱仪, 按测定法进行测定，结果见表3。

表3 含量测定结果（n=3）

不同产地的三个黄酮含量相差较大。其中木犀草素含量在若尔盖县样品中最高；芹菜素含量在若尔盖县样品中最高；芫花素含量在色达县样品中最高。

3 与原含量测定方法比较。

分别采用单独测定和同时测定的方法测定同一批药材，比较两方法测定3个黄酮含量结果的差异。结果见表4。

表4 两方法测定比较结果（n=3）

4 讨论

4.1 运用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱, 可在22 min内对美花筋骨草的3种主要成分进行含量测定，参照‘3’项下测定结果新方法（梯度洗脱）与原方法(等度洗脱，2个溶剂系统)基本相同，表明HPLC梯度洗脱法测定美花圆叶筋骨草中3种主要成分含量比原方法简便、易于操作。

4.2 根据采集的3批药材中木犀草素、芹菜素、芫花素三成分平均含量分别0.0157%～0.157%，0.00219%～0.160%，0.00456%～0.0268%范围内。结果显示：各地的黄酮含量相差较大；各地的木犀草素平均含量都是相对最高的；除了芫花素，若尔盖县其他成分的含量都是相对最高的；除了若尔盖县，其他两地的三成分平均含量高低顺序为：木犀草素＞芫花素＞芹菜素。表明美花筋骨草不同的生长环境对三个黄酮的含量有较大影响。为探索影响黄酮含量的原因，可从生长环境方面进行相关研究。4.3 实验对提取条件进行了考察。在查阅文献的基础上，本实验考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯三个提取溶剂，考察了10 mL、20 mL、25 mL、50 mL四个溶剂用量，考察了超声、回流、静置三种提取方法，考察了0.5 h、1 h、2 h三个提取时间，最终选择甲醇50 mL，超声1 h为提取条件，目标成分提取率较高，分离度较好，干扰的杂质峰较少，且方法简单，成本较低。

4.4 实验对流动相系统进行了考察。查阅文献考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.3%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.3%磷酸水及其不同比例的流动相系统，最终选择甲醇-0.1%甲酸水溶液，目标峰达基线分离，且重复性好。

4.5 实验对柱温进行了考察。查阅文献考察了25 ℃、30 ℃、37 ℃，温度越低柱压越高，保留时间越长，但分离度越好，根据实际操作，选择25 ℃，此温度分离度较好，柱压也在要求范围内。

[1] 四川省食品药品监督管理局.四川省藏药材标准[M].成都;四川科学技术出版社,2014:137.

[2] 宇妥宁玛•云丹贡波.四部医典（藏文）[M].木刻版.德格印经院.公元8世纪.

[3] 中国科学院西北高原生物研究所.藏药志[M].西宁:青海人民出版社.1991:119-121.

[4] 邓放.美花圆叶筋骨草的化学成分与质量研究[D].成都:中医药大学,2009.

[5] 中国国家药典委员会,中华人民共和国药典,一部[S].北京;中国医药科技出版社,2015:138.

(责任编辑：李芸霞)

The content determination of three fl avonoids of Meihuajingucao by HPLC method/

ZHANG Hui, XIA Hou-lin,YANGMeng-ni ,DENG Fang//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To develop a simultaneous content determination method of three fl avonoids of Meihuajingucao using HPLC.Method:Three fl avonoids ingredients of Meihuajingucao ( luteolin, apigenin and genkwanin) were detected with HPLC on a C18chromatographic column (4.6 mm×250 mm, 5 µm), using methanol-0.1% formic acid aqueous solution gradient elution.Detection wavelength of luteolin, apigenin and genkwanin was 350 nm, 3 40 nm and 336 nm, respectively.Result:A simultaneous determination content method of three fl avonoids of Meihuajingucao was developed. Three ingredients had perfect separation, and the methodology met the requirements.Conclusion:The analytical method is simple, accurate with good reproducibility, which can be applied in the simultaneous determination of three fl avonoids.

Meihuajingucao; gradient elution; fl avonoids; determination

R 284.2

A

] 1674-926X(2017)02-006-03

四川省教育厅应用基础研究：炮制前后藏药美花筋骨草质量和药效的对比研究（15ZB0088），四川省青年科技创新研究团队（2016TD0006）

成都中医药大学，中药材标准化教育部重点实验室 ，四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地，成都，611137）

张慧，女，硕士，主要从事中药质量控制方向研究。Tel:13880459062 Email:zhanghui9101@163.com

邓放，男，副教授，硕士生导师，主要从事中药及其复方物质基础和质量控制方向研究。Tel:13684090383 Email:dengf99@163.com

2016-09-21