抗诺氟沙星单克隆抗体的制备及其性质的研究

徐田丽 苏国成 江晓颖 孙雪珂 江峰

摘要：为了监测诺氟沙星抗生素的滥用，我们开发了一种基于单克隆抗体的酶联免疫方法。将小分子抗原诺氟沙星NOR通过碳二亚胺法与载体蛋白BSA、OVA进行偶联。得到完全抗原NORBSA和NOROVA。用NORBSA对3只雌性小鼠进行免疫后，利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，用间接ELISA法和间接竞争ELISA法筛选阳性细胞进行克隆，得到3株稳定分泌抗体的单克隆细胞株，分别命名为7C4，8G3，11G7。检测细胞的上清液和纯化后的腹水效价，分别为1：512，1：1024，1：1024和1：128000，1：128000，1：128000。对三株细胞的亚型鉴定为IgG2b，IgG2b，IgG1。建立的标准竞争曲线计算得IC50值为31.225 ng，其检测线性范围为 5.011630.95 ng/mL，最低檢出量为2.75 ng。亲和力常数Kaff为4.6×108。诺氟沙星单克隆抗体与环丙沙星（27.22%）、恩诺沙星（11.29%）、奥比沙星（11.03%）、氧氟沙星（9.73%）、达氟沙星（7.38%）、沙拉沙星（2.57%）、二氟沙星（0.61%）几种抗菌药有较低的交叉反应率。

关键词：诺氟沙星；单克隆抗体；间接竞争酶联免疫吸附试验；性质

Abstract： To monitor the abuse of Norfloxacin （NOR）， developing a monoclonal antibody （mAb） based enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） is our future goal.The small molecule antigen NOR was conjugated with BSA and OVA proteins by EDC method.Then NORBSA conjugate and NOROVA can be obtained.Three female mice were immunized by NORBSA conjugate.And the hybridoma cell lines were obtained by cell fusing technology.Positive cells were screened by indirect ELISA and indirect competitive ELISA.Finally， three hybridoma cell lines named 7C4， 11G7 and 8G3 were screened out.The titer of cell culture supernatant and the ascites titer after purification of three hybridoma cell lines were 1：512， 1：1024， 1：1024 and 1：128000， 1：128000，1：128000 respectively.The subtypes of three cells were IgG2b， IgG2b， IgG1.The competition standard curve was developed by indirect ELISA， the half maximal inhibitory concentration（IC50） was 31.225 ng， the detection of linear range was 5.011 ng ～ 630.95 ng， and the detection limit was 2.75 ng.The affinity constant Kaff was 4.6×108.There have low crossreactivity between ciprofloxacin （27.22%）， enrofloxacin （11.29%）， orbifloxacin （11.03%）， ofloxacin （9.73%）， danofloxacin （7.38%）， sarafloxacin （2.57%）， difloxacin （0.61%） antimicrobial agents.

Key words：Norfloxacin；Monoclonal antibody；Indirect competitive ELISA；Characterization

随着经济的发展，人们生活水平提升了许多，对于肉、蛋、奶及相关副食品的数量和质量也提出了更高的要求。兽药在保障动物性食品供应上，发挥着不可替代的作用[1]。氟喹诺酮类原料药（FQs）是第三代合成抗生素，其具有光谱抗菌性，广泛用于在畜牧业和人类的各种疾病的预防和治疗[2]。由于他们可以进入食物链和导致细菌的耐药性，而对人类的健康存在潜在的危险。诺氟沙星（NOR）是一种合成氟喹诺酮类抗生素，通过破坏消化道内致病细菌的DNA螺旋酶，防止细菌DNA复制，因此达到抗菌性，针对许多致病性革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，包括耐庆大霉素、绿脓假单胞菌和抗药性金黄色葡萄球菌[3]。……