特定因子诱导猪胎儿成纤维细胞重编程为多能性细胞的研究

李 雪，王玉阁，文丽波，王 滨，姚宏波，赵 堃

（1．齐齐哈尔医学院生理教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2．齐齐哈尔医学院组织胚胎教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

・实验研究・

特定因子诱导猪胎儿成纤维细胞重编程为多能性细胞的研究

李 雪2，王玉阁1，文丽波1，王 滨1，姚宏波1，赵 堃2

（1．齐齐哈尔医学院生理教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2．齐齐哈尔医学院组织胚胎教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

目的应用特定因子诱导猪胎儿成纤维细胞重编程为多能性细胞。方法 应用经典的Yamanaka方法，诱导猪胎儿成纤维细胞重编程，创建形态以及特征与猪上胚层细胞来源相似的猪多能性细胞（pig induced pluripotent cells，piPCs）。结果 应用特定因子诱导猪胎儿成纤维细胞重编程为piPCs。该细胞AKP染色阳性；体外长期传代都保持正常的染色体核型。结论 成功的应用特定因子诱导猪胎儿成纤维细胞重编程为猪多能性细胞。

猪成纤维细胞；重编程；诱导多能干细胞

诱导性多能干细胞（iPS细胞）技术经过近15年的发展，在生物学、医学等领域取得了重大突破，对疾病的基础研究和转化均具有重要意义。模式动物猪因其具有特殊生理结构，尤其是小型猪的器官体重和大小都与人体非常相似、由于取材便利、基因序列和人类相似程度较高的优势，一直成为国内外研究的热点[1]。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）的建立，为体细胞重编程创建了新方法。目前，已有文献报道建立了猪iPS细胞，但在细胞多潜能特性分析中仍存在差异[2]。本实验应用特定因子诱导胎猪成纤维细胞重编程，并在重编程的过程中对培养体系进行优化，创建与猪上胚层细胞来源相似的多能性细胞，且在体外经过长期传递后仍维持未分化状态。该成果的取得为进一步探讨猪胚胎干细胞多能作用、以及对畜牧业生产工作提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验中采用的猪胎儿成纤维细胞来源于妊娠35～40天的猪胚胎。培养基、Oct4，Sox2，c-Myc、胎牛血清（FBS）以及Klf4四种逆转录病毒试剂均购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 诱导及培养猪多能性细胞

选择第2代胎猪成纤维细胞，按一定密度接种，培养24 h后，按等比例的感染剂量将hOct4、hSox2、hc-Myc、hKlf4四种逆转录病毒液混合加入，加4 μg/mL聚凝胺（polybrene）以促进病毒粘附。24 h后，进行重复感染。24 h后，记为D0。从D0到D7，在培养液中添加2 mM VPA，隔天换液。D8，重新接种在饲养层细胞上，用iPS培养液培养。D14，培养皿中若发现突出于饲养层细胞表面，高核质比，大核仁，边缘整齐的与猪上胚层细胞形态类似的克隆。经过形态学方式选择出典型的克隆，传代扩增。

1.2.2 碱性磷酸酶AKP（alkaline phosphatase）染色

按照碱性磷酸酶显色试剂盒（购自Beyotime公司）说明书操作后，镜下分析染色结果。

1.2.3 核型分析

选取对数生长期中的猪多能性细胞（P30），在培养液中注入秋水仙素（10 μg/mL），培养箱孵育1.5 h。向细胞中注入KCL溶液（0.075 mol/L）37℃作低渗处理15 min。混合溶液4℃保持20 min。离心后将悬浮细胞利用胶头滴管以0.5米的高度滴到-20℃预冷的载玻片上。Giemsa染液进行染色10 min，在流动水下冲洗后油镜开始观察染色体标本，计数后拍照。

1.2.4 Real-time PCR分析

在病毒感染后D12，分别提取mRNA，进行Real-time PCR扩增，检测应用不同培养温度对重编程的影响。组别如下：a，37℃、b，39℃。取1 μg mRNA经RT-PCR试剂盒逆转录得到相应的cDNA，以上述cDNA为模版。引物序列，扩增片段长度，退火温度见表1。

表1 各种引物序列及退火温度

1.2.5 统计数据及分析

实验数据经Student t-检验进行统计学计算分析，P＜0.05为差异性有显著性意义，所有数据用均数±标准差表示。

2 结 果

2.1 培养温度对重编程的影响

猪正常体温为39℃，为了确定培养温度对细胞重编程的影响，我们将胎猪成纤维细胞及病毒因子诱导后的细胞分别置于37℃和39℃条件下的培养箱分别培养，观察是否39℃的培养条件会提高重编程效率。在重编程早期，即四种病毒因子感染成纤维细胞后的D12，对2种温度条件下的细胞进行real-time PCR检测，以测定早期重编程阶段猪内源性多潜能因子Oct4，Sox2，Nanog，Klf4的表达水平，结果如图1所示：两种温度下分别培养的细胞在早期重编程因子的启动表达方面未见显著差异，说明培养温度对猪成纤维重编程的影响较小。

图1 real-time PCR检测分别应用37℃和39℃培养条件，猪多潜能基因的表达水平

2.2 胎猪多能性细胞的建立

诱导流程如图2A所示。在D0至D7持续添加2 mM VPA。在D8将细胞接种于饲养层上，改换iPS培养液，换液时观察细胞形态变化。从D12开始，在镜下观察到少量的细胞呈上皮样生长，其形态明显区别于成纤维细胞；D14，出现1～2个集落样形态生长的克隆，随着诱导时间的延长，集落数量逐渐增多；在D20，我们观察到了比较典型的类似小鼠ES形态的克隆。细胞形态变化如图2B所示。

图2B 猪多能性细胞建立过程中细胞形态学改变

2.3 猪多能性细胞多潜能性鉴定

我们所建立的piPCs显现出高水平的碱性磷酸酶活性能力，呈棕色，如图3a。该细胞经过体外长期传代后（P30）仍具有正常染色体核型（2n=38）如图3b。

图3 猪多能性细胞的鉴定

3 讨 论

iPS技术开创了细胞重编程的全新方法，本文研究中发现，我们利用小鼠和人iPS细胞建立的方法[3,4]，对猪胎儿成纤维细胞进行诱导重编程，创立了piPCs细胞。但至今尚未建立猪ES细胞系，与细胞生物学特性有关的报道相对较少，所以在猪多能性细胞鉴定中存在很大的争议[5,6]。本次实验中，我们将病毒感染后的细胞分别用39℃和37℃进行培养，进行Real-time PCR检测内源性多潜能基因的表达，结果显示重编程开启后内源性转录因子的表达水平并没有显著差异，说明培养温度对早期猪体细胞重编程没有促进作用，但是温度是否对猪体细胞重编程晚期有促进作用还需要进一步的验证。综上，虽成功建立猪多能性细胞的前期结果令人振奋，但猪多能性干细胞的研究领域仍然存在许多问题有待解决。例如，从根本上表述体细胞重编程、猪多能性干细胞自我更新以及定向分化的分子调控机制等，在今后实验中仍然值得深入研究。

[1]江虎军,冯 锋,等.模式动物与人类疾病的动物模型[J].生命科学,2011,23(3):234-238.

[2]薛冰华,刘忠华.猪多能性干细胞研究进展与前瞻[J].生物技术通报,2015,31(4):82-91.

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[5]刘忠华.猪多能性干细胞与人类遗传疾病模型[J].中国基础科学,2015,17(4).

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ISSN.2095-8242.2017.042.8141.02

本文编辑：王雨辰