一种国产丙肝抗体检测试剂在血液筛查中的应用评价

范加诚*，华玉娟，苏 涛，范风涛

（泰安市红十字会中心血站，山东 泰安 271000）

一种国产丙肝抗体检测试剂在血液筛查中的应用评价

范加诚*，华玉娟，苏 涛，范风涛

（泰安市红十字会中心血站，山东 泰安 271000）

目的通过与核酸检测（NAT）以及一种基于间接法免疫检测原理的酶联免疫吸附法（ELISA）试剂相比较，评估另一种基于双抗原夹心法免疫检测原理的ELISA试剂在献血者丙肝检测方面的表现。方法 用NAT和两种免疫检测原理的ELISA试剂分别对39976份无偿献血者血样进行平行检测，并采用丙肝病毒抗体重组免疫印迹（HCV RIBA）试剂进行补充实验，分析比较结果。结果 在检测HCV Ab上，夹心法原理ELISA试剂特异性优于间接法原理ELISA试剂，差异有统计学意义（P＜0.05），前者与NAT比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 夹心法原理ELISA试剂与NAT结合应用于献血者丙肝病毒筛查，可以有效减少漏检和降低由假反应性造成的血液报废。

双抗原夹心法；HCV；ELISA；NAT；血液筛查

丙型肝炎也是一种危害严重的传染性疾病，由丙型肝炎病毒（HCV）感染发病，HCV主要经血液传播感染，在我国十分流行[1]，感染率约3.2%[2]。目前，我国血站采用间接法免疫检测原理的酶联免疫吸附法（ELISA）试剂检测丙肝病毒抗体（HCV Ab），该方法用于血液筛查十分有效，但是依旧存在漏检与假阳性等问题[3]。而采用双抗原夹心法免疫检测原理的ELISA试剂能从方法学的基础原理上有效地解决了间接法免疫检测原理中所存在的某些缺陷，并且在近年双抗原夹心法原理的ELISA试剂在HBsAg、HIV Ag/Ab和梅毒TP等的相关检测中都获得了比较成功的实践效果，具有更好的特异性和灵敏度。本实验室自2016年初即开始采用双抗原夹心法和间接法两种免疫检测原理的ELISA试剂同时用于献血者血样HCV Ab的筛查，并采用核酸（NAT）进行HCV RNA检测，得到大批量标本检测数据进行性分析，报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月～2016年10月本血站采集的无偿献血者标本39976份，5 mL EDTA-K2抗凝剂3管，其中1管为惰性分离胶试管用于核酸检测，标本保存于4℃冰箱，4 h内分离血浆，于48 h内完成检测，反应性标本吸取血浆后-40℃冰柜冻存备用于RIBA补充实验。

1.2 仪器与试剂

试剂A：双抗原夹心法酶联免疫丙肝病毒检测试剂（北京万泰公司，批号：CS20151007，CS20160403）；试剂B：间接法酶联免疫丙肝病毒检测试剂（上海科华公司，批号：201511281，201604141）；核酸检测试剂：罗氏三联血筛试剂MPX2.0（罗氏诊断公司，批号：193607）；RIBA试剂：丙肝病毒重组免疫印迹HCV RIBA（北京万泰公司，批号：RC20160501）；Tecan EVO 150/8智能加样器（瑞士帝肯公司），Hamilton FAME 24/20酶免处理系统（瑞士Hamilton 公司），XK95-Ⅰ型多用振荡器（江苏新康公司）。

1.3 方法

每份血样均采用试剂A、试剂B平行检测HCV Ab，并且同步采用核酸检测（NAT）试剂检测HCV RNA，以上检测出的所有反应性样本均采用HCV RIBA进行补充实验。所有检测结果均严格按照所用试剂说明书要求进行判读。

1.4 统计学方法

通过SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，计数资料用x2检验，P＜0.05有统计学差异。

2 结 果

2.1 试剂A、试剂B以及核酸试剂的检测

同时对39976份无偿献血者标本采用试剂A、试剂B以及NAT进行平行检测，检出反应性标本48例，其中试剂A反应性标本21例，试剂B反应性标本43例，NAT反应性标本9例。试剂A与试剂B检测结果有统计学差异（P＜0.05，表1），试剂A与NAT检测结果有统计学差异（P＜0.01，表1）。

表1 试剂A、试剂B以及NAT的检测

2.2 反应性标本的RIBA补充实验

48例反应性标本均采用RIBA试剂进行补充实验，其中确认阳性11例，不确定5例，阴性32例。两种ELISA法及NAT检测结果与RIBA结果对应情况见表2。两种ELISA试剂均有反应性的标本中RIBA确认阳性结果11例（11/16，68.75%），RIBA不确定结果5例（5/16，31.32%）。11例RIBA阳性标本中有9例RNA反应性（9/11，81.82%），2例RNA无反应性（2/11，18.18%）。32例RIBA阴性标本中单试剂A反应性标本5例（5/32，15.63%），单试剂B反应性标本27例（27/32，84.37%）。

表2 48例标本补充实验检测结果（n）

3 讨 论

目前，血站实验室对于HCV Ab检测一般都会采用间接法原理的酶联免疫试剂，即用有酶标记的抗人IgG作为第二抗体，对血浆/清中的抗HCV IgG进行相关的检测[4]，但是由于血浆/清中一些非特异性IgG吸附和一些类风湿因子的干扰等.也很容易造成一些假阳性反应出现[5]，从而造成一些不必要的血源浪费。血站传染病筛查项目HBsAg、HIV Ag/Ab和TP均已采用双抗原夹心法原理的酶联免疫试剂，并且在实际使用中表现出良好的特异性及灵敏度。双抗原夹心法原理主要是利用酶标抗原代替间接方法当中的相关酶标记二抗，从方法学上有效地解决了在间接法中存在的一些缺陷，所以从理论上具有更好的特异性和灵敏度。同时，在一些相关研究中也表明酶联免疫吸附试验所涉及的夹心法与间接法HCV Ab检测仍会存在一定程度漏检[6]。

本研究结果显示双抗原夹心法原理的酶联免疫试剂与间接法原理的试剂的检测结果具有统计学差异（x2=4.80，P＜0.05），RIBA检测结果阴性标本中夹心法酶免试剂检测假阳性率为15.63%而间接法酶免试剂假阳性率为84.37%，提示夹心法酶免试剂的特异性明显优于间接法酶免试剂，并且在实际应用中前者采用50微升标本加样量而后者采用10微升标本加样量，标本加样量的增加可以更加有效地避免实验操作中由于加样量不足或漏加而造成的漏检现象。近几年为了避免“窗口期”感染的漏检而引入核酸检测（NAT）应用于血液安全筛查中，但是从以上检测数据可以得出NAT检测不能单纯替代ELISA法，二者只能互为补充，表1显示NAT与ELISA法检测结果具有明显统计学差异（x2=7.57，P＜0.01），表2显示2例ELISA法双试剂均为反应性且RIBA确认阳性标本而NAT为无反映性，分析原因可能有：1、HCV RNA含量低于检出限或RNA间歇复制造成NAT假阴性结果[7-8]；2、感染后病毒已清除但抗体持续存在[9]。

综上所述，采用夹心法原理的酶联免疫试剂在丙肝抗体检测方面明显优于间接法原理的试剂，具有更好的特异性及敏感性，前者试剂替代后者试剂应用于采供血机构大批量血液筛查中，能极大程度地降低由于检测假反应性而造成的血源浪费。同时，据报道NAT极大地缩短了丙肝检测的“窗口期”，可将HCV 70天窗口期缩短到10～14天[10]。所以该夹心法原理的酶联免疫试剂替代传统的间接法试剂，与NAT结合应用于献血者丙肝筛查，从方法学上做到互为有益的补充，能够更加有效地保证临床输血安全。

[1]陆亭屹,徐萍.HCV抗体ELISA测定中影响因素探讨[J]实用医技杂志.2009,15(26):3542-3543.

[2]成 军.丙型肝炎病毒致病的分子学机制[J].解放军医学杂志,2003.28(1):23-27.

[3]郭宏雄,李卫中,李琦涵,等.HCV；表位多克隆抗体的纯化及HCV-Ag的检测[J].内蒙古石油化工,2010.13(04):4-6.

[4]冯国钢.抗-HCV抗体与HCV-RNA定量检测相关性分析[J]吉林医学,2011,32(02):244-245.

[5]甄志军,李荣雪,张志红.溶血对国产新型间接法试剂检测HCV抗体的影响[J]国际检验医学杂志,2012,33(22):2792-2793.

[6]邱 艳,高 渡,叶建伟,等.抗-HCV酶免试剂用于血站血液筛查的效果评价.临床输血与检验,2003,5:88-90.

[7]Beach MJ,Meek EL,Mimms LT,et al.Temporal relationships of hepatitis C virus RNA and antibody responses following experimental infection of chimpanzees.J Med Virol,1992,36(3):226-237.

[8]Farci P,Alter HJ,Wong D,et al.A long-term study of hepatitis C virus replication in non-A,non-B hepatitis.N Engl J Med,1991,325(2):98-104.

[9]Irving WL,Day S,Eglin RP,et al.HCV and PCR negativity.Lancet,1992,339(8806):1425.

[10]National institutes of Health Concensus Develpoment Conference Panel.Management hepatitis C.Hepatology,1997,26(1):2-10.

Evaluation of the application of a domestic HCV ELISA assay in blood screening

FAN Jia-cheng*,HUA Yu-juan,SU Tao,FAN Feng-tao
(The Taian Blood Bank,Shandong Taian 271000,China)

Hepatitis C virus;Sandwich method;ELISA;Blood Screening

R446.6

A

ISSN.2095-8242.2017.042.8252.02

泰安市科技发展基金项目（项目编号：2015NS1125）

范加诚，男，医学硕士，副主任技师，主要从事血液安全筛查和实验室质量管理方面的工作，E-mail：fjctttt2008@126.com

本文编辑：王雨辰

【Abastrac】ObjectiveTo evaluate the differences of domestic reagent that is Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in hepatitis C blood screening by comparing using Indirect ELISA and nucleic acids (NAT) detection.Methods A total of 39976 donor samples were tested for HCV detection through parallel detection by Sandwich ELISA,Indirect ELISA and NAT.The HCV reactive samples were con firmed by recombinant immunoblot assay (RIBA).Analysis and comparison were conducted on all results. Results The specificity of Sandwich ELISA reagent was higher than Indirect ELISA reagent (P＜0.05).And there was difference between Sandwich ELISA reagent and NAT (P＜0.01).Conclusion Using both domestic Sandwich ELISA reagent and NAT together for detection of hepatitis C,that can effectively reduce the number of undetected blood samples and avoid false reactive.