藏茵陈4种有效成分的含量测定

张慧，杨孟妮，李洋，刘娟，李文婷，夏厚林

藏茵陈4种有效成分的含量测定

张慧，杨孟妮，李洋，刘娟，李文婷，夏厚林

目的：建立藏茵陈4种有效成分的含量测定方法，并测定10批不同来源的含量。方法：采用HPLC（高效液相色谱法）法，同时测定藏茵陈中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷和芒果苷的含量，采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长238 nm（獐牙菜苦苷）、274 nm（龙胆苦苷）、246 nm(獐牙菜苷)和258 nm（芒果苷）。结果：建立了HPLC法同时测定藏茵陈中四种有效成分含量的方法，四种成分分离度良好，方法学考察符合要求。结论：本方法操作简便，结果准确，重复性好，可靠性好，可用于同时测定藏茵陈中四种有效成分的含量。

藏茵陈；有效成分；HPLC；含量测定

藏茵陈为多基源药材，本研究所用藏茵陈（Artemisiae)为来源于龙胆科(Gentianaceae)獐牙菜属（Swertia)植物川西獐牙菜（Swertia mussotii Franch.)印度獐牙菜（Swertia chirayita (Roxb.ex Flemi)Karste.)的干燥全草。藏茵陈是贵重的八珍藏药之一，藏药名为蒂达，为藏药中最具特色的治疗‘赤巴’病，清诸热，治血病，胆病等的常用药[1]。藏医所说的赤巴诸症与汉医理论中的中焦诸病略同，特别是广义的肝胆症更接近赤巴症。查阅相关文献，其所含獐牙菜苦苷主要具有清热、消炎等生理作用[2～5]。獐芽菜苷能有效保护肝细胞，并能促进细胞修复[6,7]，龙胆苦苷具有保肝、健胃、抗氧化等作用[8]，芒果苷主要具有抗氧化[9,10]、抗结核[11]和抗菌作用[12,13]以及保肝利胆作用。

根据本课题组前期药理筛选显示其活性成分集中在大极性部位。由于上述4种成分在大极性部位含量相对较高，而其药理作用又与古籍记载的清肝胆，解诸热等功效息息相关，因此对该4种成分进行含量测定，有着重要的意义。由于HPLC法常用于单体成分含量的测定，故本实验拟采用HPLC法建立同时测定4种有效成分含量的方法。本方法准确可靠，稳定性好，可用于藏茵陈的质量评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BS124S电子分析天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器，北京有限公司)，HPLC高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1200 Series)，KQ-600DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷（购自成都曼斯特生物科技有限公司 中国科学院成都生物研究所，经HPLC面积归一化法检测含量达到98%以上)，甲醇（色谱纯)，磷酸（色谱纯)，水（超纯水)，其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

药材来源见表1，S1、S3、S6和S10药材经成都中医药大学卢先明教授初步鉴定为龙胆科獐牙菜属植物川西獐牙菜的干燥全草；S2、S4、S5、S7、S8和S9药材初步鉴定为龙胆科獐牙菜属植物印度獐牙菜的干燥全草；S11为S1的花叶部分；S12为S1的根茎部分。

表1 实验用藏茵陈样品来源

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 混合对照品溶液 精密称量獐牙菜苦苷，龙胆苦苷，獐牙菜苷和芒果苷对照品各适量，加甲醇配制成混合对照品储备液，取适量储备液稀释至每1 mL含獐牙菜苦苷0.2 mg，龙胆苦苷0.06 mg，獐牙菜苷0.14 mg，芒果苷0.5 mg，即得混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取本品粉末（过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，超声处理（功率600W，频率40kHz)1h，过滤，加甲醇定容至25 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2 方法学考察

2.2.1色谱条件 以岛津Inertsil ODS-3 C18（250*4.6mm，5μm)为色谱柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱；检测波长238 nm（獐牙菜苦苷)、274 nm (龙胆苦苷)、246 nm（獐牙菜苷)和258 nm（芒果苷)；流速：1.0 mL﹒min-1；柱温：25℃；进样量：20 μL；采集时间：30 min，洗脱程序见表1。在此条件下藏茵陈中獐牙菜苦苷（保留时间为：12.08 min)，龙胆苦苷（保留时间为：16.12 min)，獐牙菜苷（保留时间为：18.87 min)，芒果苷（保留时间为：26.67 min)与其他组分在30 min内均能达到基线分离(见图1)

表1 流动相比例表

图1 藏茵陈对照品HPLC色谱图

图2 藏茵陈样品HPLC色谱图

2.2.2 线性关系的考察 分别取‘2.1.1’项下混合对照品溶液0.5mL、2mL、3mL、3.3mL、3.6mL、4mL，加相应溶剂至4mL。分别进样20 μL。以进样量(μg)为横坐标，峰面积（A)为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程见表2。结果表明獐牙菜苦苷在0.5μg～4 μg，龙胆苦苷在0.15μg ～1.2 μg，獐牙菜苷在0.35μg ～2.8 μg，芒果苷在1.25μg ～10 μg之间有较好的线性关系。

表2 藏茵陈中4种成分线性回归方程

2.2.3 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液，按“2.2.1”条件重复进样6次测定峰面积，结果对照品中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分别为0.67%，0.71%，0.70%，0.85%，表明方法精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 精密吸取‘2.1.2’中供试液溶液20 μL，按“2.2.1”条件分别于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h进样测定峰面积，结果样品中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分别为0.69%，1.26%，1.57%，0.71%，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.2.5 重复性试验 取同一样品粉末6份，各约0.5 g，精密称定，制备成供试品溶液，按“2.2.1”条件进行测定，结果獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分别为1.31%，1.40%，1.26%，1.28%，表明方法重复性良好。

2.2.6 加样回收试验 精密称定已知含量的药材粉末0.25g共6份，精密加入适量獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷对照品按供试品溶液制备及测定法操作，进行色谱分析，结果獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的平均回收率分别为95.31%，92.70%，91.95%，94.87%，RSD分别为1.11%，1.05%，1.03%，0.54%，表明方法准确度良好。

2.3 样品测定

准确吸取‘2.1.2’项下供试品溶液各20 μL, 注入液相色谱仪, 按测定法进行测定。结果见表3。由表可见不同来源的藏茵陈各有效成分的含量相差较大。

表3 样品中各有效成含量（n=3)

3 讨论

3.1 本实验对10批藏茵陈全草开展了4种有效成分的含量测定，由表3结果横向观察显示：10个样品中4种有效成分含量的高低顺序都呈现出芒果苷＞獐牙菜苦苷＞獐牙菜苷＞龙胆苦苷；纵向观察显示：獐牙菜苦苷和芒果苷含量最高的批次都为购自西藏的1601（编号S3)，龙胆苦苷含量最高的批次为购自西藏的1511（编号S1)，獐牙菜苷含量最高的批次为购自西藏的1603（编号S10)，4种成分含量最低的批次都为购自新都的1602（编号S2)。总体来说各有效成分含量最高的批次都为西藏采购，说明西藏采购的质量较优。该含量差异可能与基源、环境以及采收加工有关。

3.2 獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷都属于环烯醚萜苷类，该三成分的含量总和显示：S1、S3、S6和S10的全草样品普遍高于其他6个批次全草样品，结合基源鉴定结果初步说明川西獐牙菜环烯醚萜苷类含量可能高于印度獐牙菜。该含量差异主要与基源不同有关，提示了明确药材的来源对藏茵陈研究的重要性。

3.3 本实验对S1药材进行了分部位研究，由表3结果显示横向对比：分部位研究也符合4种有效成分含量芒果苷＞獐牙菜苦苷＞獐牙菜苷＞龙胆苦苷的分布；纵向比较S1、S11和S12显示：獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和芒果苷含量都为S11（花叶)＞S1（全草)＞S12（根茎),龙胆苦苷含量则为S12（根茎)＞S11（花叶)，该结果初步提示藏茵陈中獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和芒果苷成分主要存在于花叶中，龙胆苦苷主要存在于根茎中。藏茵陈的临床用药都是全草入药，由于市场上购买的样品大部分都是经过产地加工后将根茎花叶分离，导致临床用药可能因为取药不均导致质量不一，分部位研究可以有效的指导临床用药。由于本实验对分部位研究仅进行了一个初探，进一步确证需要加大批次进行研究。

3.4 芒果苷属于口山酮类，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷属于环烯醚萜苷类，由表可知每个样品都呈现出芒果苷单体的含量大于另外三个环烯醚萜苷总和的含量，提示芒果苷在该两个来源中的重要性，推测可能为其主要活性成分。

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Determination of four active ingredients of Zangyinchen/

ZHANG Hui,YANG Meng-ni, LI Yang, LIU Juan, LI Wen-ting,XIA Hou-lin//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan )

Objective: To establish determination method of four effective components in Zangyinchen, and detect the content 5 of 10 batches samples from different sources. Method: High performance liquid chromatography (HPLC) method was used for the simultaneous determination of swertiamarin, gentiopicroside, swertiamarin and mangiferin in Zangyinchen on C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), with methanol-0.1% phosphoric acid water solution as mobile phase in gradient elution. The detection wavelength was set at 238 nm (swertiamarin) , 274 nm (gentiopicroside), 243 nm (sweroside) and 258 nm (mangiferin).Result: The HPLC simultaneous determination of four effective components in Zangyinchen was established with good separation,and met the methodological requirements. Conclusion: The method is simple, accurate with ood repeatability and reliability, which can be used for the simultaneous determination of four effective components in Zangyinchen.

Zangyinchen; effective components; HPLC; determination of content

A

1674-926X(2017)04-004-04

成都中医药大学，中药材标准化教育部重点实验室, 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地。

张慧(1991—），女，药物分析硕士，主要从事中药质量控制研究。Tel：13880459062 Email：zhanghui9101@163.com

夏厚林(1964—)，男，教授，主要从事药物分析学、物理化学研究。Tel：13568899011 Email：XHL64@163.com

2016-08-08

（责任编辑：李芸霞)