中药淫羊藿薄层色谱鉴别方法的建立

谢媛媛，彭灵，苏加坤，罗娟敏，王义明，郭磊，蔡继宝，罗国安

中药淫羊藿薄层色谱鉴别方法的建立

谢媛媛1，彭灵1，苏加坤2，罗娟敏2，王义明3，郭磊2，蔡继宝2，罗国安1

目的：建立淫羊藿薄层鉴别方法。方法：以朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷混合溶液为对照品，对淫羊藿进行薄层鉴别，并考察了不同点样量、不同薄层板、不同温度及不同湿度对淫羊藿薄层鉴别的影响。结果：以朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷混合溶液为对照品，以甲醇∶丁酮∶氯仿∶水（4∶6∶6∶1）为展开系统，5 μL点样量点样于Merck硅胶铝箔板时，所得的薄层色谱斑点清晰，专属性强。结论：该鉴别方法操作简便，重复性好，可作为淫羊藿的薄层鉴别方法。

淫羊藿；朝藿定A；朝藿定C；淫羊藿苷；薄层鉴别

淫羊藿Epimedii Folium药材来源复杂，2015年版《中国药典》规定：淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi. 或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶[1]。2001年出版的《中国植物志》记载的淫羊藿主要种类有7种：箭叶淫羊藿、淫羊藿、粗毛淫羊藿、朝鲜淫羊藿、柔毛淫羊藿、黔岭淫羊藿及巫山淫羊藿[2]。淫羊藿是我国传统的补益中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，在阳痿、遗精、筋骨酸软、手足麻木拘挛、更年期高血压、心脑血管疾病[3,4]、提高机体免疫力[5,6]、抗肿瘤[7]及抗衰老[8]等方面有着显著的疗效[9]。

淫羊藿中成分主要为含有异戊烯基取代的黄酮类化合物。包括淫羊藿苷、宝藿苷I、宝藿苷II、宝藿苷V、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、脱水淫羊藿素、去甲基脱水淫羊藿素、大花淫羊藿苷B、大花淫羊藿苷C、大花淫羊藿苷F、淫羊藿次苷、箭藿苷A、箭藿苷B等[10]。薄层色谱法操作简便、设备简单、成本相对低廉、分离快速，被广泛应用于中药鉴别领域。本实验对淫羊藿进行薄层色谱鉴别，是为了有效地控制其质量，为淫羊藿的质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

电子精密天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；KM-12A型超声波清洗机（广州市科洁盟实验仪器有限公司，功率60W，频率40KHz）；SP-20E型全自动点样仪（上海科哲生化科技有限公司）、GoodSee-20E薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）、25 μL微量进样针（宁波市镇海玻璃仪器厂）；101-1AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；硅胶G板（北京和信同通科技发展有限公司）；硅胶GF254铝箔板、硅胶GF254玻璃板（德国Merck公司）。

朝藿定A（纯度99.25%，批号 110623-72-8）、朝藿定C（纯度 98.93%，批号 110642-44-9）和淫羊藿苷（纯度 99.31%，批号 489-32-7）均购于四川省维克奇生物制药有限公司；淫羊藿对照药材（批号：Z09S7B20761）购于上海源叶生物科技有限公司；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。淫羊藿药材经清华大学化学系分析中心谢媛媛鉴定为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi.、巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying和朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱条件的考察

2.1.1 药材供试品及对照药材溶液的制备 取淫羊藿粉末1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取淫羊藿对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷各1mg混溶于1 mL甲醇，作为混合对照品溶液。

图1 点样量的考察

2.1.3 点样量的考察 分别吸取2 μL、5 μL、8 μL、10 μL淫羊藿供试品溶液点样于同一薄层板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开剂，展开，取出，晾干，再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯（365nm）下检视。结果见图1。结果表明，点样量为5 μL时斑点较清晰、无晕染情况，故确定供试品的点样量为5 μL。2.1.4条带宽度的考察 吸取淫羊藿供试品溶液分别以5 μL点样量点2 mm、4 mm、6 mm、8 mm、10 mm的条带于同一薄层板上，以甲醇∶丁酮∶氯仿∶水（4∶6∶6∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图2。结果表明，条带宽度为10mm时，斑点较清晰、无晕染情况，故确定点样的条带宽度为10 mm。

图2 条带宽度的考察

2.2 方法学考察

2.2.1 稳定性考察 取同一批淫羊藿药材，按2.1.1供试品溶液制备方法，制备4份供试品溶液，分别于室温下保存不同时间（0天、1天、2天、3天）。吸取对照品溶液和上述4份供试品溶液各5 μL，点于同一薄层板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开剂，展开，取出，晾干，再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图3。结果表明，在3天内供试品溶液稳定性良好。

图3 稳定性考察

2.2.2 耐用性考察

（1）不同薄层板的考察 吸取混合对照品溶液、淫羊藿对照药材溶液、淫羊藿供试品溶液各5 μL，点样于3种不同的薄层板（Merck硅胶铝箔板、Merck硅胶玻璃板和北京硅胶G板）上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开系统，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图4。结果表明，Merck硅胶铝箔板的分离效果优于Merck硅胶玻璃板和北京硅胶G板。

图4 淫羊藿在Merck硅胶铝箔板 (A)、Merck硅胶玻璃板(B)、Merck硅胶玻璃板(C)上展开的薄层色谱图

（2）不同展开温度的考察 吸取混合对照品溶液、淫羊藿对照药材溶液、淫羊藿供试品溶液各5 μL点于3块Merck硅胶铝箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开系统，分别在4 ℃、室温（25 ℃）、32 ℃的条件下展开，取出，晾干，再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图5。结果表明，展开温度对展开效果影响不大，故选择室温（25 ℃）下展开。

图5 淫羊藿在4 ℃ (A)、25 ℃ (B)、32 ℃(C)下展开的薄层色谱图

（3）不同展开湿度的考察[11]吸取混合对照品溶液、淫羊藿对照药材溶液、淫羊藿供试品溶液各5 μL点于3块Merck硅胶铝箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开系统，分别在相对湿度32%、58%、88%的条件下展开，取出，晾干，再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图6。结果表明，相对湿度对展开效果及斑点的清晰度影响较小。

图6 淫羊藿在32% (A)、58% (B)、88% (C)湿度下展开的薄层色谱图

2.3 淫羊藿药材的薄层鉴别

2.3.1 箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim. 按照2.1和2.2确定的色谱条件，将对照品溶液、对照药材溶液及供试品药材点于Merck硅胶铝箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开系统，展开，取出，晾干。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图7、图8。

图7 第1～6批箭叶淫羊藿TLC图

图8 第7～12批箭叶淫羊藿TLC图

2.3.2 朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai 按照2.1和2.2确定的色谱条件，将对照品溶液、对照药材溶液及供试品药材点于Merck硅胶铝箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开系统，展开，取出，晾干。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图9、图10。

图9 第1～6批箭叶淫羊藿TLC图

图10 第7～9批朝鲜淫羊藿TLC图

2.3.3 巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying 按照2.1和2.2确定的色谱条件，将对照品溶液、对照药材溶液及供试品药材点于Merck硅胶铝箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开系统，展开，取出，晾干。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图11。

图11 第1～4批巫山淫羊藿TLC图

2.3.4 淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim. 按照2.1和2.2确定的色谱条件，将对照品溶液、对照药材溶液及供试品药材点于Merck硅胶铝箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开系统，展开，取出，晾干。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图12。

图12 第1～3批淫羊藿TLC图

2.3.5 柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi. 按照2.1和2.2确定的色谱条件，将对照品溶液、对照药材溶液及供试品药材点于Merck硅胶铝箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）为展开系统，展开，取出，晾干。再喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图13。

图13 柔毛淫羊藿TLC图

以上箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai、巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying、淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.和柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi.的薄层色谱结果表明，本实验所建立的淫羊藿薄层色谱鉴别方法分离度高，重现性好，可用于淫羊藿药材的鉴定并为淫羊藿药材的质量控制提供参考依据。

3 讨论

3.1 本实验前期参考相关文献[11,12,13]，对淫羊藿供试品制备方法中提取溶剂（50% 甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇）、溶剂体积（5 mL、10 mL、15 mL）及超声处理时间（30 min、40 min、50 min）进行了考察。实验结果表明，以10 mL甲醇作为溶剂，超声30 min时薄层展开效果最佳。

3.2 实验中对淫羊藿的薄层鉴别方法中的点样量（2 μL、5 μL、8 μL、10 μL）、条带宽度（2mm、4mm、6mm、8mm、10mm）、不同薄层板（Merck硅胶铝箔板、Merck硅胶玻璃板、北京硅胶G板）、不同展开温度（4 ℃、25 ℃、32 ℃）及不同展开湿度（32%、58%、88%）进行了考察，结果表明点样量为5 μL，点样于Merck硅胶铝箔板时效果最好，而温度和湿度对淫羊藿薄层色谱的展开影响较小；对各批不同种的淫羊藿进行薄层鉴别，色谱斑点明显、分离效果好。本实验建立的淫羊藿薄层色谱鉴别方法朝藿定A、朝藿定C及淫羊藿苷斑点清晰，重复性好，可作为淫羊藿药材的一种鉴定方法，为淫羊藿药材的质量控制提供参考依据。

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Establishment of TLC identi fication method of Yinyanghuo/

XIE Yuan-yuan1, PENG Ling1, SU Jia-kun2, LUO Juan-min2,WANG Yi-ming3, GUO Lei2, CAI Ji-Bao2, LUO Guo-an1//(1. Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China.2.Tobacco Jiangxi Industrial Co., Ltd., Nanchang 330096, Jiangxi. 3. Zhuhai Qingda Hongrui Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai 519085, Guangzhou)

Objective: To establish a TLC method for the identification of Yinyanghuo. Method: The TLC was used to identify epimedin A, epimedin C and icariin. The effect of volume of application, thin layer plates, temperature and humidity on the TLC identi fication of Yinyanghuo were investigated. Result: With epimedin A, epimedin C and icariin as the reference substances, 5 μL volume of application, TLC spots on the Merck silica gel aluminum foil plate were clear and TLC identi fi cation of Yinyanghuo was high specific with Methanol-butanone-chloroform-water (4：6：6：1) as the developing system. Conclusion: The method established for Yinyanghuo is feasible and reproducible, and can be used for Yinyanghuo identification.

Yinyanghuo; epimedin A; epimedin C; icariin; TLC identi fi cation

R 284.1

A

1674-926X(2017)04-006-05

中国烟草总公司重大专项项目[项目编号：110201401025(JH-03)]

1.清华大学化学系，北京，100084；2.江西中烟工业有限责任公司，江西 南昌 330096；3.珠海清大弘瑞生物科技有限公司，广东 珠海 519085

谢媛媛（1980-），女，博士，主要从事中药质量分析研究Tel： 010-62772264 Email：yuanyuan_sy@tsinghua.edu.cn

王义明（1945-），女，本科，主要从事生命分析化学研究Tel：010-62781688 Email：wangyim@tsinghua.edu.cn

2017-03-10

（责任编辑：蒋淼）