猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的原核表达、纯化及活性检测

张二芹 ， 滕 蔓 ， 罗 俊 ， 赵孟孟 ， 许倩茹 ， 赵 东 ， 邓瑞广 ， 张改平

(1.河南省农业科学院 河南省动物免疫学重点实验室 农业部动物免疫学重点实验室 ， 河南 郑州 450002 ；2.河南农业大学牧医工程学院 ， 河南 郑州 450002)

猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的原核表达、纯化及活性检测

张二芹1，2， 滕 蔓1， 罗 俊1， 赵孟孟2， 许倩茹2， 赵 东1， 邓瑞广1， 张改平2

(1.河南省农业科学院 河南省动物免疫学重点实验室 农业部动物免疫学重点实验室 ， 河南 郑州 450002 ；2.河南农业大学牧医工程学院 ， 河南 郑州 450002)

在大肠杆菌BL21(DE3)中表达乙脑病毒(JEV)EDⅢ蛋白、镍柱纯化并检测表达蛋白。采用RT-PCR方法扩增EDⅢ基因片段，构建重组表达载体pET-28a-EDⅢ并转化到BL21(DE3)菌，经IPTG诱导蛋白表达，表达可溶性产物经Ni-NTA亲和层析纯化，最后通过SDS-PAGE和Western-Blot检测表达蛋白。结果成功构建原核表达载体pET-28a-EDⅢ；EDⅢ蛋白在BL21(DE3)菌已表达，经Ni-NTA获得纯化蛋白，并经Western-Blot检测具有反应活性。

乙脑病毒 ； EDⅢ蛋白 ； 表达蛋白

乙脑是由日本乙型脑炎病毒引起的一种急性人兽共患传染病。经三带喙库蚊等蚊虫叮咬传播感染中枢神经系统。JEV属于黄病毒科黄病毒成员,乙脑病毒为球形，直径40 nm，单股正链RNA病毒。病毒基因组全长约为11 kb，自5′至3′依次编码结构蛋白C、M、E及非结构蛋白NS1-NS5。结构蛋白E[1-8]是JEV的主要保护性抗原，E糖蛋白上有中和抗原表位和血凝抗原表位，可诱发机体产生中和抗体和血凝抑制抗体，从而保护机体免受病毒的攻击。研究发现,E蛋白的抗原决定簇分为3个区域，即EDⅠ,EDⅡ和EDⅢ。其中EDⅢ蛋白具有免疫球蛋白样结构，包含有中和抗原表位，可作为黄病毒科血清学诊断抗原及免疫接种该蛋白可抗病毒。因此本试验进行了EDⅢ原核表达、纯化及生物活性检测，为进一步研究病毒的特性、诊断试剂及新型疫苗等奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pET-28a表达载体和BL21(DE3)宿主菌为本实验室保存。EDⅢ-F，EDⅢ-R引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，Ex-Taq聚合酶、连接试剂盒及反转录试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；JEV兔源多克隆抗体由本实验室保存；羊抗兔二抗，购自北京博奥星生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根据GenBank登录JEV株SA-14-14-2 EDⅢ序列合成一对引物，序列如下：

EDⅢ-F：5′- ccggaattcgacaaactggctctgaaag-3′(下划线为EcoRⅠ酶切位点)。

EDⅢ-R：5′- atactcgagcgtgcttccagctttgtg-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)。

1.2.2 EDⅢ基因的扩增及pET-28a载体的构建

根据TRIZol试剂盒说明书提取JEV RNA，合成cDNA的条件如下：模板RNA 10μL，EDⅢ-R引物1μL,70 ℃水浴10 min,冰上放置5 min,加6 μL预混液(4uL 5×Buffer,1μL dNTP,0.5 μL RNase inhibitor, 0.5 μL M-MLV)42 ℃水浴1 h，72 ℃灭活10 min。进行RT-PCR扩增，反应条件：95 ℃ 5 min;94 ℃30 s,53 ℃ 40 s,72 ℃45 s,30个循环72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶分析扩增产物，EcoRⅠ和XhoⅠ酶切回收EDⅢ和pET-28a，连接，转化EcoliBL21(DE3)感受态细胞。挑取单菌落，菌液PCR，提质粒和酶切鉴定重组载体，测序，保留阳性菌种。

1.2.3EcoliBL21(DE3)的诱导表达 取鉴定正确的菌种过夜培养，按1∶100比例加入新鲜LB培养基中培养，当OD600=0.4～0.6时，加入IPTG终浓度为0.5 mmol/L，诱导8 h。10 000 r/min离心1 min收集菌体，PBS溶解，超声破碎，收集沉淀，加入 5×SDS上样缓冲液进行样品处理，取上述样品做SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，最后脱色，观察结果。

1.2.4 表达蛋白的纯化 离心收集菌体，用50 mmol/L的PBS重悬菌液，超声破碎(破碎5s，间隔5s，共10 r/min),10 000 r/min离心10 min，收集上清，镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化蛋白，20 mmol/L咪唑漂洗液平衡镍柱，最后用100 mmol/L咪唑洗脱液洗脱蛋白，收集洗脱液，取不同浓度咪唑洗脱液进行SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western-Blot检测EDⅢ 按文献[7]的方法进行。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增EDⅢ JEV的EDⅢ基因的RT-PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，结果大约在约330 bp处有一条电泳带, 与预期片段大小相符(图1)。

图1 JEV EDⅢ基因的RT-PCR扩增产物1:标准DNA分子质量； 2.EDⅢ基因RT-PCR产物

2.2 重组表达质粒pET-28a-EDⅢ的鉴定 将EDⅢ与表达载体pET-28a连接，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，挑单菌落培养后,通过菌液PCR扩增及重组质粒酶切鉴定，可见2条分别为5 300 bp和330 bp左右的片段，与预期结果一致(图2)。

图2 重组质粒pET-28a-EDⅢ的鉴定1,4：标准DNA分子质量 ；2：菌液的PCR扩增产物；3：重组质粒pET-28a-EDⅢ的酶切产物；

2.3 表达产物SDS-PAGE分析 鉴定的阳性菌株EcoliBL21(DE3)经0.5 mmol/L的IPTG诱导8 h后，SDS-PAGE分析表达蛋白，结果大约在13 ku处有一条明显的特异性蛋白条件，大小与预期结果相符(图3)。

2.4 EDⅢ融合蛋白的纯化 利用Ni-NTA agarose柱,通过亲和层析纯化EDⅢ融合蛋白，表达菌体BL21(DE3)经沉淀、超声、变性、纯化得到EDⅢ蛋白，纯化的蛋白透析和浓缩后，应用紫外光吸收定量法测得蛋白浓度为1.9 g/L(图4)。

图3 EDⅢ蛋白的SDS-PAGE分析1：预染蛋白质Marker; 2：未诱导的pET-28a-EDⅢ;3：诱导的pET-28a-EDⅢ

图4 EDⅢ融合蛋白的纯化1：预染蛋白质Marker; 2：流穿样品r； 3,4： 平衡Buffer；5-9：洗脱的蛋白

2.5 Wetsrn-Blot检测EDⅢ蛋白 表达产物经过纯化、浓缩后，经过Western-Blot分析，结果与JEV兔源多克隆抗体呈现阳性反应，而且无非特异性条带，显示表达产物的抗原性较好(图5)。

图5 表达产物的Western-Blot 分析1：预染蛋白质Marker； 2：EDⅢ蛋白； 3：阴性对照

3 讨论

乙脑是由乙脑病毒经三带喙库蚊等蚊虫叮咬传播而引起的一种中枢神经系统感染的急性传染病，也是一种人兽共患的自然疫源性疾病。猪感染乙脑后，其主要特征为高热、流产、死胎和公猪睾丸炎,因此对养猪业也造成重大的经济损失。

为了减少养猪业的经济损失，应在潜伏期或更早阶段进行检测和鉴别诊断，以便进行积极预防。乙脑病毒E囊膜结构蛋白分为3个抗原域，其中EDⅢ区域8有中和抗原表位、可作为黄病毒科血清学诊断抗原及免疫接种该蛋白可抗病毒。Senji Tafuku9等人用大肠杆菌表达JEV的EDⅢ蛋白免疫小鼠，具有保护作用。本研究将EDⅢ基因定向克隆到pET-28a载体中，转到入BL21(DE3)菌，对表达产物经过可溶性鉴定，以可溶的形式存在，Ni-NTA纯化的EDⅢ蛋白，经SDS-PAGE检测，纯度可达到95%以上。通过Western-Blot鉴定，在13 ku处有条带，与预期结果相符。表达的蛋白能与JEV的兔源多克隆抗体反应，表明具有较好的反应原性，这为以后作为诊断试剂及新型疫苗奠定基础。

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ProkaryoticExpression,PurificationandActivityDetectionofPorcineJEVEDⅢProtein

ZHANG Er-qin1，2, TENG Man1, LUO Jun1, ZHAO Meng-meng2, XU Qian-ru2, ZHAO Dong1,DENG Rui-guang1, ZHANG Gai-ping2

(1.Henan Key Laboratory of Animal Immunology,Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture,Henan Academy of Agricultural Science, Zhengzhou 450002,China ； 2.College of Animal Scinece and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China)

EDⅢ protein of Japanese encephalitis virus(JEV) was expressed, purified and identified in Escherichia coli BL21(DE3).The gene encoding EDⅢ protein was amplified with RT-PCR and the constructed recombinant plasmid pET28a-EDⅢ was transformed into BL21(DE3). EDⅢ solubility protein by IPTG was expressed, purified by Ni-NTA affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and western-blot.The result showed that the recombinant plasmid pET28a-EDⅢ was successfully constructed, expressed in Escherichia coli BL21(DE3).The purified protein by Ni-NTA affinity chromatography possessed reactivity with its specific antibody confirmed by western-blot.

Japanese encephalitis virus ； domain Ⅲof envelope protein ; expression protein

ZHANG Gai-ping

S852.65+1

A

0529-6005(2017)09-0028-03

2016-12-16

河南省博士后科研资助项目(2013047)；河南省科技攻关计划项目(152102110127)；河南省农业科技推广财政补助资金项目(YCN201519111)

张二芹(1976-)，女，副教授，博士，主要从事动物分子病毒学及转基因植物疫苗的研究，E-mail:zhangerqin76@163.com

张改平，E-mail:zhanggaiping2003@163.com