细胞传代致弱的禽偏肺病毒JC毒株致病性变化的研究

韦 莉 , 王 菁 , 朱珊珊 , 阎 旭 , 全 荣 , 李子璇 , 侯 磊 , 齐宾宾 , 姜海军 , 刘 爵

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室 ， 北京 海淀 100097)

细胞传代致弱的禽偏肺病毒JC毒株致病性变化的研究

韦 莉 , 王 菁 , 朱珊珊 , 阎 旭 , 全 荣 , 李子璇 , 侯 磊 , 齐宾宾 , 姜海军 , 刘 爵

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室 ， 北京 海淀 100097)

将禽偏肺病毒(aMPV)JC株在Vero细胞上传代传至第50代时，细胞适应毒株毒价为105.6TCID50/mL；雏鸡致病性试验结果显示，aMPV JC株细胞传代第50代与亲本毒F0相比感染雏鸡发病率降低，病理变化减轻，表明第F50细胞适应毒的毒力减弱。

禽偏肺病毒 JC株 ； 细胞适应病毒 ； 致病性

禽偏肺病毒(avianmetapneumovirus，aMPV)属于副黏病毒科偏肺病毒属，能够引起火鸡、鸡、鸭以及野鸟等急性呼吸道感染以及产蛋的下降[1]。火鸡鼻气管炎、禽鼻气管炎和肉鸡肿头综合征都与该病毒感染有关[2]。根据吸附糖蛋白G的核苷酸序列分析和用单克隆抗体中和试验，将aMPV分为 A、B、C和D 4个亚型[3]。1978年aMPV感染首先在南非报道[4]，随后在西班牙、英国、法国、以色列、德国、匈牙利都有该病发生的报道。我国于1998年在有肿头综合征的鸡群中首次报道分离到禽肺病毒A亚型[5]。之后在山东、黑龙江、吉林、河北、湖北、新疆等地的部分鸡场进行aMPV血清学调查，发现我国鸡群中普遍存在aMPV感染[6-10]。2012年又陆续报道在鸡群中分离到B和C亚型[11-12]。

aMPV可在多种原代细胞内增殖，如鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚肝细胞(CEL)、原代火鸡鸡胚成纤维细胞(TEF)和来自于鹌鹑成纤维细胞的QT-35细胞。Patnayak等[13]又证明了aMPV也可在多种传代细胞系中增殖，如黑长尾猴肾细胞(BGM-70)、胎猕猴细胞(MA-104)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、鸡成纤维细胞(DF-1)、鼠源的McCoy细胞和叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)等，不同的aMPV毒株对不同细胞的适应性存在差异。

本研究将分离到的禽偏肺病毒C亚型JC株[12]在Vero细胞上连续传代培养，观察第50代细胞毒的动物致病性，为禽偏肺病毒细胞适应弱毒苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞、抗体和实验动物 禽偏肺病毒C亚型JC株[12]由本实验室分离、鉴定并保存。Vero细胞本研究室保存。21日龄SPF雏鸡，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 试剂和主要仪器 胎牛血清、DMEM培养基干粉、青链霉素双抗、SuperScriptTMⅢ反转录酶，均购自Gibco公司；Qiagen RNeasy Mini Kit，购自Qiagen公司。

1.3 禽偏肺病毒在细胞上的传代培养 Vero细胞长成单层后，用PBS洗2次，将病鸡组织研磨液接种于细胞，37C吸附1.5 h，弃吸附液，PBS洗2次，加入1%双抗和2% FBS的DMEM继续培养。逐日观察，培养7 d后，置于-20 ℃，反复冻融3次，作为1代病毒分离物。经过5代盲传后，出现细胞病变，收集70%～80%病变的细胞。如此反复，在Vero细胞上传代培养至细胞适应毒株第50代(F50)。

1.4 禽偏肺病毒细胞适应毒对易感SPF鸡的致病性 30只21日龄SPF雏鸡随机分为3组，滴鼻点眼分别接种禽偏肺病毒 JC株亲代毒株和第50代细胞适应毒株，0.2mL/只，标记为F0和F50组；剩余1组接种PBS，为阴性对照。隔离器中饲养2周，记录各组的发病情况。采集咽拭子和鼻甲、喉头、气管和肺脏等组织，观察组织病理变化，并提取咽拭子中总RNA，进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2 结果

2.1 禽偏肺病毒在细胞上的适应性生长 将禽偏肺病毒JC株在Vero细胞上连续传代培养，F1代至F5代，感染细胞未见明显的细胞病变；F6代以后，出现细胞聚集成团、圆缩、脱落、其间隙增宽等现象。产生的CPE与Cook[2]报道的感染特征基本一致。随着传代次数的增加，病毒滴度逐渐升高，F40～F50代病毒的滴度稳定在104.3-4.6TCID50/ 0.1mL。说明aMPV-JC株能够在Vero细胞上适应性生长。

2.2 aMPV JC株F50对鸡的致病性

2.2.1 临床表现 F0组雏鸡在感染后第3天陆续出现打喷嚏、鼻孔有分泌物流出等症状；攻毒后第5天，大部分鸡只甩头、打喷嚏，鼻部有半透明的黏液分泌出来(见中插彩版图1A)。感染后第7天F0组雏鸡发病率为100%。F50组感染后第5天1只雏鸡出现轻微流涕(见中插彩版图1B)，发病率为10%。而对照组未见任何临床症状。表明aMPV细胞适应毒F50与其亲代毒F0相比，发病率大幅降低。

2.2.2 剖检变化和病理变化 剖检发现，F0组中鼻甲有大量分泌物，或有干酪样物质，气管有大量黏液；F50组除1只发病鸡鼻甲有分泌物和气管有轻度黏液外，未发病鸡只与阴性对照鸡只一样无改变(见中插彩版图2)。

病理检查发现F0组鼻甲黏膜增厚，黏膜下血管扩张，充血；气管黏膜增厚，固有膜内淋巴细胞浸润；肺泡壁有炎性细胞浸润，腔内有出血和渗出物；F50组发病鸡只出现与F0组病理变化相同，程度略轻，在肺泡腔内未见到出血和渗出物；未发病鸡只除气管黏膜有轻度增厚外与正常对照无明显差别(见中插彩版图3)。这些结果进一步说明aMPV细胞适应毒F50与其亲代毒F0相比，毒力明显减弱。

2.2.3 发病雏鸡实验室诊断 利用本实验室建立的aMPV RT-PCR检测方法对F0和F50感染的发病鸡咽拭子进行病毒检测，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在800 bp处出现特异性条带，与预期aMPV目标条带大小一致(图4)，表明F0和F50组的发病鸡是由aMPV感染所引起。

图4 F0和F50感染鸡咽拭子病毒RNA检测M：M:DL-2 000 Marker(bp)； 1: F0； 2:F50； 3:未感染；4:阳性对照； 5：阴性对照

3 讨论

禽偏肺病毒是危害世界养禽业的重要疫病之一[2]，也是导致肉鸡肿头综合征的重要诱因之一[14]。在火鸡养殖业，aMPV引起的呼吸道疾病所造成的危害仅次于禽流感病毒，造成巨大的经济损失[15]，但其对鸡的影响却知之甚少[2]。

本研究通过对细胞适应毒致病性的研究，发现aMPV JC株在Vero细胞连续传代过程中，随着传代次数的增加，病毒滴度逐渐升高；传至第50代时，病毒滴度达104.6TCID50/0.1mL。用第50代细胞适应毒与其亲本毒感染21日龄SPF鸡，发现F50代病毒与亲本毒相比出现临床症状的鸡只大幅度减少，发病率只有10%，且发病鸡只病理改变减轻，说明F50与亲本毒相比毒力明显减弱，为今后弱毒苗的研制奠定了基础。

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PathogenicityChangesofCellAttenuatedAvianMetapneumovirusJCStrain

WEI Li , WANG Jing , ZHU Shan-shan , YAN Xu , QUAN Rong , LI Zi-xuan ,HOU Lei , QI Bin-bin , JIANG Hai-jun ，LIU Jue

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Municipal Academy of Agriculture and Forestry Sciences；Beijing Key Laboratory for Prevention and Control of Infectious Diseases in Livestock and Poultry, Beijing 100097，China)

Avianmetapneumovirus(aMPV) JC strain was propagated in Vero cells. The virus titer reached to 105.6TCID50/mL after 50 passages. Compared to parental virus, the morbidity rate decreased and the pathological changes were alleviated in chicken after being challenged with passage 50 virus. It indicated that the virulence of F50 cell adapted strain was attenuated.

avianmetapneumovirusJC strain ； cell adaptive virus ； pathogenicity

LIU Jue

S852.65 文献杯志码：A

0529-6005(2017)09-0006-02

2016-12-15

北京市科技计划项目(Z141100002314013)；国家现代农业产业技术体系肉鸡产业技术体系(CARS-42)

韦莉(1966-)，女，研究员，博士，从事动物病毒学研究,E-mail：w_lyx2008@126.com

刘爵，E-mail:liujue@263.net