米渣蛋白中谷蛋白与亚油酸的相互作用机制

耿 勤，黄 丽，杨 榕，戴涛涛，刘成梅，伍立新，吕成良，罗舜菁,*

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038；3.江西金农生物科技有限公司，江西 宜春 336400）

米渣蛋白中谷蛋白与亚油酸的相互作用机制

耿 勤1，黄 丽2，杨 榕1，戴涛涛1，刘成梅1，伍立新3，吕成良3，罗舜菁1,*

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038；3.江西金农生物科技有限公司，江西 宜春 336400）

利用荧光猝灭光谱、8-苯胺基-1-奈磺酸（1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid，ANS）结合荧光光谱、紫外-可见吸收光谱及圆二色光谱法研究了谷蛋白（rice glutelin，RG）与亚油酸复合体系的结构变化、荧光特性、结合机制及热力学特性。荧光猝灭实验结果表明：亚油酸可使谷蛋白发生荧光猝灭，猝灭机制为静态猝灭，且亚油酸与谷蛋白之间主要相互作用为疏水性相互作用。ANS结合荧光光谱、紫外-可见吸收光谱及圆二色光谱法实验数据表明：亚油酸的加入会使谷蛋白的二级结构及三级结构发生变化，α-螺旋结构含量明显增加，蛋白质稳定性增强。两者相互作用的研究可为实际生产高纯度蛋白质及新型蛋白产品提供理论依据。

谷蛋白；亚油酸；相互作用；光谱法；结构

米渣中含有丰富的大米蛋白，大米蛋白作为植物蛋白，氨基酸配比平衡合理，具有低过敏性、高生物效价、低胆固醇等特点[1]，因此，米渣蛋白资源的开发利用备受关注。其中大米谷蛋白（rice glutelin，RG）是米渣蛋白中的主要成分，RG含量高达80%左右，RG中所含丰富的谷胺酰胺在维持小肠代谢、结构和功能上也起重要的作用，因此，RG也可作为一种营养补充剂[2]。然而，因米渣蛋白中含有较多的脂肪（质量分数10%）[3]，在制备高纯度米渣蛋白的过程中，米渣蛋白中的残余脂肪可能因与蛋白质发生结合[4]，使其较难被脱除，阻碍了蛋白质的纯化。研究发现，脂肪会与蛋白质发生疏水性结合，从而改变蛋白质的结构[5]，且残余脂肪的氧化会诱导蛋白质发生一定程度的氧化[6]，这对米渣蛋白的进一步加工产生一定的影响，降低米渣蛋白产品的品质并缩短货架期[7-8]，这些问题普遍存在于脂肪含量较高的植物蛋白中，然而，目前关于植物蛋白与脂肪之间的相互作用并没有清晰的研究。

在对米渣蛋白中的脂肪酸进行测定分析时，发现其主要的脂肪酸组成为：亚油酸（linoleic acid，LA）33%、油酸26%、棕榈酸18%，其中，LA是米渣蛋白中含量最高的多不饱和脂肪酸，且LA是体内必需脂肪酸的一种，为功能性多不饱和脂肪酸[9]。

目前已有相当多的研究利用配体-蛋白质复合物的形成，对配体与蛋白质之间的结合、相互作用等进行研究[10]，但关于大米RG与油脂的结合研究鲜见报道。为研究米渣中蛋白质与脂肪的结合作用，本实验选择米渣蛋白中含量最高的RG与LA为研究对象，采用光谱学方法对RG与LA复合体中蛋白质的结构变化、荧光特性、结合机制及热力学特性进行考察，对蛋白质与脂肪的结合机制进行研究。为进一步降低脂肪含量、制备高纯度蛋白质提供实验依据，且可为结合型蛋白产品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米渣蛋白（蛋白质量分数68.64%、脂肪质量分数9.46%、水分质量分数6.37%） 江西金农生物科技有限公司；LA标准品（纯度≥99.0%）上海晶纯生化科技股份有限公司；高温α-淀粉酶（酶活力4 000 U/g） 诺维信（中国）投资有限公司；8-苯胺基-1-奈磺酸（1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid，ANS）、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

F-7000型荧光分光光度计 日立Hitachi公司；TU-1810型紫外-可见光分光光度计 北京普析通用公司；KYD-9820凯氏定氮仪 厦门精艺兴业科技有限公司；MOS-450圆二色光谱仪 法国Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 RG的提取

根据史苏华等[11]的提取方法，并稍作改进。称取100 g经石油醚浸泡脱脂后的米渣蛋白，以固液比1∶10（m/V）溶于0.1 mol/L NaOH溶液中，调pH值至11.0，并置于50 ℃的水浴中浸提3 h，将浸提液4 800 r/min离心10 min，沉淀按上述方法重复提取2 次，合并3 次的上清液，得到米渣RG粗提液。将米渣RG粗提液于55 ℃水浴锅中保温，用1 mol/L盐酸调pH值至6.5。加入5%α-淀粉酶去除淀粉多糖，水解4 h后调节pH值至4.8（RG等电点）进行酸沉，4 ℃冰箱冷沉2 h后离心弃上清液，所得沉淀分别用5% NaCl、70%乙醇和蒸馏水洗涤3 次，除去碱提过程中提取出的球蛋白、醇溶蛋白、清蛋白以及残留的无机盐。最后，沉淀物用去离子水稀释，用0.1 mol/L NaOH调回到pH 7.0，在4 ℃冰箱中透析48 h，期间，多次更换去离子水。冷冻干燥后得米渣RG粉，-20 ℃贮存备用，凯氏定氮法测得米渣RG干基质量分数为93.12%。

1.3.2 复合物制备

RG储备液[12]：称取0.2 g RG，溶于20 mL 0.01mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，室温条件下磁力搅拌2 h后，4 800 r/min离心10 min取上清液备用，上清液蛋白质量浓度采用考马斯亮蓝法测定。

LA溶液制备：称取一定量的LA溶于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，于55 ℃水浴搅拌至完全分散，溶液呈均匀乳白色，得到不同浓度LA溶液备用，0 ℃保存。

将不同体积的LA溶液加入到储备液（蛋白质量浓度50 μg/mL）中，持续搅拌2 h，制备LA浓度为0.00、1.78、3.56、7.13、14.20、17.80 mmol/L的RG-LA复合体系，该体系用于后续实验测定。

1.3.3 紫外光谱测定

复合体系的紫外光谱测定根据Zhong Dagen等[13]的方法采用紫外分光光度计测定，扫描范围为200～400 nm。对照组为实验组相应浓度的LA溶液。

1.3.4 荧光滴定实验

取充分混匀的RG-LA复合体系，置于1 cm石英比色皿中。设定激发波长为280 nm，发射波长300～500 nm，激发和发射狭缝宽度都为2.5 nm[14]。采用荧光分光光度计测定荧光光谱，对照组为实验组相应浓度的LA溶液。

1.3.5 LA与RG结合机制的研究

根据Chen Liuhua等[15]的方法采用荧光分光光度计测定。分别在温度298、304、310 K条件下测定复合体系的内源荧光，设定激发波长为280 nm，发射波长300～500 nm，激发和发射狭缝宽度都为2.5 nm，对照组为实验组相应浓度的LA溶液。

1.3.6 表面疏水性的测定

表面疏水性的测定以ANS为荧光探针，采用荧光光谱仪进行分析，参照Si Yuexiu[16-17]和Mohan[18]等的方法并稍作修改。设置激发波长为390 nm，激发和发射狭缝分别为5.0 nm和2.5 nm。20 μL 9.0×10-4mol/L的ANS加入4 mL复合体系中，充分混匀。对照组为实验组相应浓度的LA溶液。表面疏水性以ANS荧光强度来表示[19]。

1.3.7 圆二色光谱测定

复合体系的远紫外-圆二色光谱根据Wu Xuli等[20]的方法使用圆二色光谱仪进行测定。RG-LA复合体系的光谱扫描范围为200～250 nm。

1.4 数据统计

每次实验均重复3 次，取平均值。采用Origin 9.0软件对数据进行作图，采用SPSS 16.0统计软件进行Duncan显著性分析，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 复合体系的紫外扫描光谱

图1 RG-LA复合体系紫外光谱图Fig. 1 UV absorption spectra of rice gluten and linoleic acid composite system

紫外吸收光谱是一种检测结构变化及分子间相互作用的有效手段[21]，对RG-LA复合体系进行紫外扫描，扣除相应浓度LA空白，结果如图1所示（LA浓度为17.8 mmol/L的曲线趋势同曲线e，图中未显示），复合体系的紫外吸收光谱在波长278 nm附近有特征吸收峰，这是由肽链上色氨酸和酪氨酸残基的杂环π→π*跃迁引起的[22]。随着LA溶液浓度的不断增加，在278 nm波长处的吸光度不断增强，这一现象与Xu Xingfeng等[23]研究发现配体对RG影响趋势一致，表明RG结合LA后二级结构发生了一定的变化。LA引起蛋白质肽链伸展[24]，同时疏水基团之间的疏水作用减弱，π→π*和n→π*跃迁能量增大[25]，且两者之间的相互作用可用荧光光谱进一步分析测定。

2.2 荧光滴定实验

采用内源荧光滴定法可测定LA对RG内源荧光的猝灭作用。本研究利用米渣RG自身内源荧光作为探针，考察LA的复合对RG内源荧光强度的影响。

图2表示在25 ℃、pH 7.0的条件下，固定激发波长为280 nm，扫描波长为300～450 nm范围内随LA量的增加（图2）内源荧光发射光谱的变化（已扣除相应LA浓度空白）。从图2可以看出，复合体系的最大发射波长在340 nm，随着LA的不断加入，复合体系的荧光峰值强度逐渐降低，表明LA与谷蛋白之间发生了一定的相互作用，LA对RG的内源荧光产生了强烈的猝灭作用，从而使RG的空间构象发生了一定的变化[26]，这一结果与紫外扫描研究结果一致，均可表明RG的构象发生了改变。

图2 LA对RG内源荧光的猝灭光谱图Fig. 2 Effect of linoleic acid on the fluorescence-quenching spectrum of rice gluten

2.3 LA对RG结合机制的探讨

荧光猝灭机制通常可以分为动态猝灭、静态猝灭和静态动态混合猝灭3 种[27]。动态猝灭是指猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间相互作用过程，遵循Stern-Volmer方程。静态猝灭是指猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的复合物，从而导致荧光物质荧光强度降低的过程，符合Lineweaver-Burk双倒数方程。

首先假设LA对RG荧光猝灭的作用为动态猝灭，符合Stern-Volmer方程（式（1））。

式中：F、F0分别为加入猝灭体和不添加猝灭体时蛋白质的荧光强度；Kq为生物分子的猝灭速率常数/（L/（mol·s））；τ0为不存在猝灭体时荧光体的荧光寿命（通常生物大分子的荧光寿命大约为10-8s）；cQ为猝灭体的浓度/（mol/L）；KS为Stern-Volmer猝灭常数/（L/mol）。

图3 不同温度下LA对RG荧光猝灭的Stern-Volmer图Fig. 3 Stern-Volmer curves of gluten fluorescence quenching by linoleic acid at different temperatures

由图3可见，按Stern-Volmer方程作图得一直线，F0/F与LA浓度有良好的线性关系。由此表明LA对RG的荧光猝灭机制不是静态和动态的混合猝灭。根据不同温度条件下的行为来区分动态猝灭、静态猝灭。

通常动态猝灭是温度升高有利于猝灭过程的进行，所以KS会随着温度的升高而增大，而静态猝灭是温度升高使形成的复合物稳定性降低，所以KS将会随着温度的升高而减小。而从图3中可以看出，随着温度的升高曲线的斜率不断减小，即KS不断减小，这说明LA对RG的猝灭为静态猝灭过程。

表1 RG-LA复合体系在不同温度下的Stern-Volmer猝灭常数Table 1 Stern-Volmer quenching constants at different temperatures

通常各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭常数Kq为2.0×1010L/（mol·s）。根据公式可求得不同温度条件下的猝灭常数如表1所示。3 个不同温度条件下荧光猝灭速率常数远大于2.0×1010L/（mol·s），且随着温度的升高而不断减小，这进一步表明LA对RG的猝灭为静态猝灭过程，且LA与RG中的色氨酸残基结合而形成了某种具有特定结构的超分子复合物[25]。

2.4 LA与RG的结合位点数

静态猝灭符合Lineweaver-Burk双倒数方程（式2）：

式中：F和F0分别为加入LA和不添加LA时蛋白的荧光强度；n为结合位点数；K0为静态猝灭结合常数/（L/mol）；cLA为LA的浓度/（mol/L）。

以lg（F0/F-1）对lg cLA作图（图4），可得出LA与RG的K0和n。

图4 不同温度下RG-LA复合体系lg（F0/F- 1）-lg cLA双对数图Fig. 4 Double logarithmic graphs from lg(F0/F-1)-lg cLA of gluten and linoleic acid composite system at different temperatures

表2 lg（F0/F -1）对lg cLA拟合曲线的回归方程、相关系数和结合位点数Table 2 Fitting regression equations, correlation coefficients and number of binding sites of lg(F0/F-1) against lg cLA curve

由表2可知，LA与RG的K0较大，表明LA与RG的结合能力较强，且K0随温度升高也略有增大，可能是由于随着温度的升高复合物稳定性略有提高从而导致K0变大[12]。同时，在不同温度条件下n均约等于1，表明LA与RG有一个相对独立的结合位点。

2.5 作用力类型的确定

RG与LA的热力学参数可通过式（3）、（4）计算：

式中：K为结合常数/（L/mol），T为实验温度/K，R为气体常数（8.314 J/（mol·K））。

通过热力学参数焓变和熵变的大小可以确定小分子物质与生物大分子RG之间的主要作用力。根据式（3），以1/T为自变量，ln K为应变量，拟合曲线，根据斜率截距算出焓值和熵值，将ΔH、ΔS代入式（4），根据温度计算出ΔG。若ΔH＞0和ΔS＞0表明为疏水作用[28]；ΔH＜0和ΔS＜0为范德华力和氢键[29]；ΔH＜0和ΔS＞0表明静电相互作用[30]；ΔG＜0表明结合过程是自发的[31]。

表3 RG-LA复合体系的热力学参数值Table 3 Thermodynamic parameters of linoleic acid and gluten composite system

由表3可知，ΔH＞0和ΔS＞0表明LA与RG之间的相互作用主要为疏水作用，且ΔG＜0表明结合过程是由焓和熵驱动的自发过程。

2.6 表面疏水性的测定结果

图5 不同浓度RG-LA复合体系的ANS结合荧光光谱Fig. 5 ANS fluorescence spectra of linoleic acid and gluten composite system

在中性条件下，以ANS为荧光探针的荧光光谱法测定不同浓度RG-LA复合体系的表面疏水性，结果如图5所示，随着LA浓度的增加，复合体系的荧光强度降低，这主要是因为ANS是一种非共价荧光探针，可以通过非共价键疏水性作用与蛋白质的疏水性区域结合[32]，而LA同样与RG的表面疏水性基团结合，使RG表面疏水性区域减少，减少了RG与ANS的结合，而导致测定的表面疏水性降低[33-34]。复合体系荧光最大吸收峰发生了红移，表明蛋白质的三级结构发生改变。

2.7 圆二色光谱测定结果

图6 不同浓度RG-LA复合体系的圆二色光谱图Fig. 6 CD spectra of linoleic acid and gluten composite system

对RG-LA复合体系的圆二光谱进行测定，结果如图6所示，复合体系在210 nm左右有一个明显的负峰，是α-螺旋的特征峰，属于α-螺旋中肽链的π→π*跃迁[35]。随着LA浓度增加，复合体系在210 nm波长处峰的振幅明显增强，但峰的位置并没有发生明显地位移。这说明LA与RG结合后，RG的二级结构发生了变化，与紫外扫描结果一致，且RG中α-螺旋结构含量明显增加，蛋白质稳定性增强[36]。

3 结 论

本实验以米渣蛋白中RG与LA为研究对象，对复合体系中蛋白的结构变化、荧光特性、结合机制及热力学特性进行考察，研究RG与LA之间的相互作用。荧光猝灭光谱结果表明，LA会与RG自发结合，且LA对RG的荧光猝灭机制为静态猝灭，两者之间的主要相互作用为疏水性相互作用。采用紫外-可见光谱法、ANS结合荧光光谱及圆二色光谱3 种结构测定手段，分析了RG结合LA后结构的变化。结果表明，RG结合LA后三级结构及二级结构发生改变，α-螺旋结构含量显著增加，蛋白质稳定性增强。

明确脂肪与蛋白质间的相互作用，可为植物蛋白中脂肪的脱除提供实验指导，为进一步制备高纯度植物蛋白，提高产品的附加值及利用率提供理论基础。后续实验可进一步研究不同条件下脂肪与蛋白质的相互作用，为实际生产提供理论依据。

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Interaction Mechanism of Gluten and Linoleic Acid in Rice Dreg Protein

GENG Qin1, HUANG Li2, YANG Rong1, DAI Taotao1, LIU Chengmei1, WU Lixin3, LÜ Chengliang3, LUO Shunjing1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Nanchang Institute for Food and Drug Control, Nanchang 330038, China; 3. Jiangxi Jin Nong Biological Technology Co. Ltd., Yichun 336400, China)

Structural changes, fluorescence characteristics, binding mechanism and thermodynamic features of gluten and linoleic acid composite system in rice dreg protein were studied using fluorescence quenching spectroscopy,1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (ANS) fluorescence spectroscopy, ultraviolet-visible (UV-Vis) absorption spectroscopy and circular dichroism (CD) spectroscopy. The fluorescence spectral results showed that the endogenous fluorescence of gluten was significantly quenched by linoleic acid and the mechanism of fluorescence quenching was static quenching. The major driving force was hydrophobic interactions. Meanwhile, the ANS fluorescence, UV-Vis absorption and CD spectral data showed that the secondary and tertiary structure of gluten were changed by the addition of linoleic acid. A significant increase in α-helix structure content was observed and protein stability was enhanced. This study will provide a theoretical basis for the production of high-purity protein and innovative protein product systems.

gluten; linoleic acid; interaction; spectroscopy; structure

10.7506/spkx1002-6630-201721024

TS213.3

A

1002-6630（2017）21-0152-06

耿勤, 黄丽, 杨榕, 等. 米渣蛋白中谷蛋白与亚油酸的相互作用机制[J]. 食品科学, 2017, 38(21): 152-157.

10.7506/spkx1002-6630-201721024. http://www.spkx.net.cn

GENG Qin, HUANG Li, YANG Rong, et al. Interaction mechanism of gluten and linoleic acid in rice dreg protein[J]. Food Science,2017, 38(21): 152-157. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721024. http://www.spkx.net.cn

2016-08-22

耿勤（1992—），女，硕士，研究方向为食品（含生物质）资源的开发利用。E-mail：gengqin00@163.com

*通信作者：罗舜菁（1969—），女，教授，硕士，研究方向为现代高新技术与食品加工工程。E-mail：luoshunjing@aliyun.com