杭州地区流行非结核分枝杆菌鉴定、易感因素和耐药性分析

吴亦斐，刘 伟，谢 捷，吴琍敏，王 乐，陆 敏，孙爱华，谢 立

杭州地区流行非结核分枝杆菌鉴定、易感因素和耐药性分析

吴亦斐1，刘 伟1，谢 捷1，吴琍敏1，王 乐1，陆 敏1，孙爱华2，谢 立1

目的了解近年杭州地区非结核分枝杆菌(NTM)感染、优势菌种及其耐药性。方法采用PNB/TCH生长试验对1 972例患者分枝杆菌阳性培养物标本中NTM进行初步鉴定。采用分枝杆菌分子线性探针法和16S rRNA基因PCR产物测序鉴定NTM菌种。分析性别和年龄对NTM易感性的影响。采用浓度比例法检测NTM分离菌株对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、氧氟沙星(OFX)、卡那霉素(KM)的敏感性。结果9.8%(193/1 972)分枝杆菌阳性培养物标本PNB/TCH生长试验结果阳性。分子线性探针法和16S rRNA基因PCR产物测序结果显示，193例PNB/TCH生长试验阳性标本中，66.3%为单一NTM、18.1%为2种分枝杆菌、8.3%为结核分枝杆菌、7.3%为非分枝杆菌属细菌感染。173株NTM(单一感染128株+混合感染45株)中，胞内分枝杆菌占57.8%，其次为脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌和鸟分枝杆菌(12.1%、9.8%、9.8%和5.8%)。35例分枝杆菌混合感染标本中，28.5%和20.0%分别为胞内分枝杆菌或龟分枝杆菌与结核分枝杆菌混合感染。NTM感染者男性多于女性(1.67∶1)，50岁以上人群感染率(80.4%)高于50岁以下人群(P<0.01)，肺部感染比例(95.1%)远高于其他部位(P<0.01)。NTM分离株对INH耐药率为100%，对其他5种抗结核药物的耐药率也高达70.3%～90.6%。结论胞内分枝杆菌是杭州地区近年优势流行的NTM菌种，NTM主要引起肺部感染且中老年人易感，NTM临床菌株对常用抗结核药物有很高的耐药性。

非结核分枝杆菌；分离与鉴定；优势流行；易感因素；耐药性

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指结核分枝杆菌复合群结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)以及麻风分枝杆菌(M.leprae)以外的分枝杆菌属其他分枝杆菌。NTM可侵犯人体各种器官和组织，但主要引起肺部感染，其致病过程和临床表现与肺结核极为相似，且又多见于原发慢性肺部疾病愈后患者，故未进行NTM分离培养及鉴定时，常被误诊为肺结核病[1]。近年来，NTM感染性疾病的发病率不断增高，但NTM分离鉴定有一定难度且NTM往往对多种抗结核药物耐药，故NTM感染性疾病诊治成为临床难点之一[1-5]。本研究中，我们对近年收集的1 972例杭州地区分枝杆菌阳性培养物进行了NTM分离鉴定及其药物敏感试验，以期了解本地区NTM流行现状、致病特点及其耐药性。

1 材料与方法

1.1临床标本来源 2015年1月-2016年12月来自杭州地区各区县结核病定点医院1 972例患者临床标本分枝杆菌阳性培养物。

1.2NTM初步鉴定 采用硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鉴别培养法对上述分枝杆菌阳性培养物进行初筛及鉴定，若该菌在PNB鉴别培养基上能生长，则初步判定为NTM[6]。PNB和TCH培养基均购自杭州市创新生物技术有限公司。

1.3细菌DNA模板制备 刮取NTM菌苔悬于0.01 mol/L、pH7.4磷酸缓冲盐水(PBS)中，95 ℃水浴灭活20 min，室温冷却后12 000 r/min离心5 min(4 ℃)，取菌体沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒(OMEGA)提取DNA，紫外分光光度法测定其纯度和浓度[7]。

1.4寡核苷酸探针杂交试验 采用分枝杆菌分子线性探针法菌种鉴定试剂盒(GenoType Mycobacterium CM/AS Kit, Hain Lifescience GmbH)对初筛判定为NTM菌株进行菌种鉴定。根据该试剂盒操作说明书，分别采用PCR扩增靶基因片段、扩增产物与膜条上线性排列的寡核苷酸探针杂交、杂交条带显色和结果判读。

1.516S rRNA基因检测与产物测序 不同分枝杆菌16S rRNA引物由上海生工生物工程技术有限公司(Sangon)提供，Ex-Taq高保真PCR试剂盒由大连宝生物技术有限公司(TaKaRa)提供，16S rRNA基因扩增产物由Sangon公司测序，对初筛判定为NTM菌株进行菌种再次鉴定。

1.6药物敏感试验 根据我国《结核病实验室检验规程》采用间接比例法检测获得纯培养的NTM菌株药物敏感性[8]。接种环刮取一环各NTM菌株对数生长期培养物，无菌磨砂管碾磨后用PBS配制成1.0麦氏浓度菌液，然后用PBS分别稀释成10-2和10-4CFU/mL菌液，取0.01 mL各稀释菌液均匀密集划线接种于不同含药培养基上，37 ℃培养4～8周观察结果。含药培养基所用异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)购自杭州市创新生物技术有限公司，氧氟沙星(OFX)和卡那霉素(KM)购自珠海贝索生物技术有限公司

2 结 果

2.1NTM菌株初步鉴定结果 上述1 972例分枝杆菌阳性培养物中，193例在PNB和TCH鉴别培养基上均有分枝杆菌生长，初步判定为NTM。

2.2分子线性探针法和16S rRNA基因测序法鉴定结果 分子线性探针法检测结果显示，上述193例初步判定为NTM标本中，8.3%(16/193)为结核分枝杆菌、7.3%(14/193)为非分枝杆菌属细菌、66.3%(128/193)检出单一NTM、18.1%(35/193)同时检出两种分枝杆菌。16S rRNA基因PCR产物测序法对193例初步判定为NTM标本的鉴定结果与分子线性探针法完全相同。128例单一NTM感染标本中，65.5%(84/128)为胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)，14.8%(19/128)、7.8%(10/128)和5.5%(7/128)分别为脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)和鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)，其余8例鉴定出6种NTM(表1)。35例分枝杆菌混合感染标本中，28.5%(10/35)为胞内分枝杆菌+结核分枝杆菌混合感染，20.0%(7/35)、14.3%(5/35)和14.3%(5/35)分别为龟分枝杆菌+结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌+结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌+龟分枝杆菌混合感染，其余8例分属6种混合感染模式(表2)。检出的173株NTM(单一感染128株+混合感染45株)中，57.8%(100/173)为胞内分枝杆菌，12.1%(21/173)、9.8%(17/173)、9.8%(17/173)和5.8%(10/173)分别为脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌和鸟分枝杆菌(表3)。

2.3NTM感染标本类型与分布 163例NTM感染标本(单一感染128例+混合感染35例)中，93.3%(152/163)为痰液，其余6.7%(11/163)标本分别为血液(3例)、支气管肺泡灌洗液(3例)、尿液(2例)、胸腹水(1例)、肠淋巴结穿刺液(1例)和颈部淋巴结穿刺液(1例)，肺部感染比例95.1%(155/163)远高于其他部位4.9%(8/163)(P<0.01)。

表1 128例单一NTM感染标本鉴定结果
Tab.1 Identification results of 128 cases with single NTM infection

非结核分枝杆菌NTM例数(n)Case百分率(%)Percentage胞内分枝杆菌M．intracellulare8465．5脓肿分枝杆菌M．abscessus1914．8堪萨斯分枝杆菌M．kansasii107．8鸟分枝杆菌M．avium75．5龟分枝杆菌M．chelonei21．6草分枝杆菌M．phlei21．6偶然分枝杆菌M．fortuitum10．8瘰疬分枝杆菌M．scrofulaceum10．8下出分枝杆菌M．shimoidei10．8脓毒分枝杆菌亚种M．stomatepiae10．8合计Total128100

表2 35例分枝杆菌混合感染标本鉴定结果
Tab.2 Identification results of 35 cases with Mycobacteria-mixed infection

混合感染模式Mixedinfectionmode例数(n)Case百分率(%)Percentage胞内分枝杆菌+结核分枝杆菌M．intracellulare+M．tuberculosis1028．5龟分枝杆菌+结核分枝杆菌M．chelonei+M．tuberculosis720．0堪萨斯分枝杆菌+结核分枝杆菌M．kansasii+M．tuberculosis514．3胞内分枝杆菌+龟分枝杆菌M．intracellulare+M．chelonei514．3偶然分枝杆菌+结核分枝杆菌M．fortuitum+M．tuberculosis25．7鸟分枝杆菌+龟分枝杆菌M．avium+M．chelonei25．7脓肿分枝杆菌+结核分枝杆菌M．abscessus+M．tuberculosis12．9胞内分枝杆菌+鸟分枝杆菌M．intracellulare+M．avium12．9龟分枝杆菌+堪萨斯分枝杆菌M．chelonei+M．kansasii12．9堪萨斯分枝杆菌+脓肿分枝杆菌M．kansasii+M．abscessus12．9合计Total35100

表3 不同类型NTM感染标本综合结果
Tab.3 Combined results of cases with different NTM-infected types

非结核分枝杆菌NTM感染类型Infectiontype单一感染Singleinfection混合感染Mixedinfection例数(n)Case百分率(%)Percentage胞内分枝杆菌M．intracellulare841610057．8脓肿分枝杆菌M．abscessus1922112．1堪萨斯分枝杆菌M．kansasii107179．8龟分枝杆菌M．chelonei215179．8鸟分枝杆菌M．avium73105．8偶然分枝杆菌M．fortuitum1231．7草分枝杆菌M．phlei2021．2瘰疬分枝杆菌M．scrofulaceum1010．6下出分枝杆菌M．shimoidei1010．6脓毒分枝杆菌亚种M．stomatepiae1010．6合计Total12845173100

2.4NTM感染患者性别和年龄分布 163例NTM感染标本(单一感染128例+混合感染35例)中，62.6%(102/163)为男性，37.4%(61/163)为女性，男女比例为1.67∶1，年龄范围19～96岁，80.4%(131/163)患者年龄为50岁以上(表4)，其感染率显著高于50岁以下人群(P<0.01)。

表4 163例NTM感染患者性别和年龄分布
Tab.4 Distribution of sex and age of 163 NTM-infected patients

年龄(岁)Age例数/百分率(n/%)Case/Percentage男性Male女性Female合计(n/%)Total19～304/2．55/3．09/5．530～403/1．84/2．57/4．340～5010/6．16/3．716/9．850～6013/8．012/7．425/15．360～7026/16．015/9．241/25．270～8028/17．214/8．642/25．880～18/11．05/3．023/14．1合计(Total)102/62．661/37．4163/100

2.5NTM药敏试验结果 从128例单一感染NTM患者标本中获得纯培养的128株NTM临床菌株均对异烟肼耐药，对利福平、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星和卡那霉素总耐药率分别为90.6%(116/128)、82.8%(106/128)、84.4%(108/128)、86.7%(111/128)和70.3%(90/128)(表5)。

3 讨 论

近年来，NTM感染所致疾病的发病率呈上升趋势，全国不少地区分枝杆菌阳性培养物标本中NTM检出率升高[3,9-10]。本研究中，我们检测了2015年1月～2016年12月杭州地区1 972例患者临床标本分枝杆菌阳性培养物，最终确定128例单一感染NTM、35例两种分枝杆菌混合感染，NTM总感染率或分离率为8.3%(163/1972)，远低于全国20%～25%的感染率或分离率[9-11]。PNB/TCH生长试验是经典的鉴别结核分枝杆菌复合群和NTM初筛试验，一般认为该法简便、价廉，主要缺点为耗时、不能确定菌种。我们的PNB/TCH生长试验结果显示，1 972例分枝杆菌阳性培养物中，193例能在PNB鉴别培养基上生长，但有15.5%(30/193)经分子线性探针法和16S rRNA基因测序法检测后确定非为NTM，其中16例为结核分枝杆菌、14例为非分枝杆菌属细菌感染。此外，分子线性探针法和16S rRNA基因测序法检测结果显示，两种方法对193例PNB/TCH生长试验阳性NTM标本鉴定结果完全相同。上述PNB/TCH生长试验所鉴定的NTM中存在结核分枝杆菌和非分枝杆菌属细菌的情况以往也有报道[12]。上述资料提示，耐PNB结核分枝杆菌或非分枝杆菌属细菌是PNB/TCH生长试验初筛NTM误差较大的主要原因，PNB/TCH生长试验必须联合分子线性探针法或16S rRNA基因测序法才能确定NTM。

表5 128株NTM对6种抗结核药物的耐药率
Tab.5 Resistance rates against 6 antituberculosis drugs of 128 NTM isolates

非结核分枝杆菌NTM株数(n)Case耐药株数/耐药率(n/%)Resistantstrains/Resistancepercentage异烟肼INH利福平RFP链霉素SM乙胺丁醇EMB氧氟沙星OFX卡那霉素KM胞内分枝杆菌M．intracellulare8484/10083/98．865/77．471/84．578/92．956/66．7脓肿分枝杆菌M．abscessus1919/10018/94．718/94．719/10017/89．515/78．9堪萨斯分枝杆菌M．kansasii1010/1005/50．09/90．05/50．03/30．09/90．0鸟分枝杆菌M．avium77/1005/71．46/85．77/1007/1003/42．9龟分枝杆菌M．chelonei22/1000/02/1002/1002/1002/100草分枝杆菌M．phlei22/1002/1002/1002/1002/1002/100偶然分枝杆菌M．fortuitum11/1000/01/1001/1001/1001/100瘰疬分枝杆菌M．scrofulaceum11/1001/1001/1000/01/1001/100下出分枝杆菌M．shimoidei11/1001/1001/1000/00/00/0脓毒分枝杆菌亚种M．stomatepiae11/1001/1001/1001/1000/01/100合计Total128128/100116/90．6106/82．8108/84．4111/86．790/70．3

本研究中共检出173例NTM(单一感染128例+混合感染45例)感染病例，引起混合感染NTM均在单一感染10个NTM种范围内。值得关注的是，高达57.8%(100/173)的分离菌株为胞内分枝杆菌，其次为脓肿分枝杆菌12.1%(21/173)、堪萨斯分枝杆菌9.8%(17/173)、龟分枝杆菌9.8%(17/173)和鸟分枝杆菌5.8%(10/173)，其余5种NTM合计仅占4.6%(8/173)，表明本地区以胞内分枝杆菌为优势致病NTM，与临近上海地区龟分枝杆菌感染率最高(26.7%)明显不同[13]。在NTM中，鸟胞内分枝杆菌复合群(MAC)和快速生长型分枝杆菌(RGM)感染最常见[1]。Hoefsloot等(2013)报道，约50%NTM感染者的病原体为MAC[14]。澳大利亚和日本NTM感染者的病原体为MAC的比例分别高达90%和74%[15]。我国福建和山东地区NTM感染的病原体也以MAC为主[10,16]，但上海和广州地区以RGM为主要，其次为MAC[3,13]。本研究中，属于MAC的胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌共检出127例，占73.4%(127/173)，属于RGM的脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌和偶然分枝杆菌共检出41例，占23.7%(41/173)，与福建和山东地区相似而与上海和广州地区不同。不同地区优势流行NTM与地理、气候及环境差异有关[1]。

NTM为条件致病菌，其致病性远低于结核分枝杆菌，免疫力下降是NTM主要易感因素[1]。我们的研究结果也显示，50岁以上人群感染率显著高于50岁以下人群(P<0.01)，提示中老年人群可因免疫力下降而导致NTM感染率增高。此外，本研究中发现35例患者为两种分枝杆菌混合感染，提示混合感染可能是NTM致病另一重要途径。Simons等(2011)报道，67.2%东亚地区NTM引起肺部感染，其次为淋巴结病变[17]。本研究中，95.1%患者为NTM肺部感染，其比例不仅远高于其他感染部位(P<0.01)，同时也高于Simons等报道的肺部感染率(P<0.05)。

异烟肼、链霉素、利福平和乙胺丁醇是临床一线抗结核药物，氧氟沙星和卡那霉素也用于治疗结核病。如前所述，NTM通常对多种抗结核药物耐药[1-5]。本研究中，我们从单一NTM感染者标本中分离获得了128株NTM菌株并对其耐药性进行了检测。药物敏感试验结果显示，上述NTM菌株对6种抗结核药物有很高的耐药率，对异烟肼耐药率为100%，对其他5种抗结合药物耐药率也高达70.3%～90.6%。上述资料提示，临床诊断为NTM感染性疾病后，应分离菌种进行药物敏感试验，根据药物敏感试验结果选择多种抗结核药物进行治疗以提高疗效。

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IdentificationofpredominantprevailingnontuberculosismycobacteriainHangzhouandanalysisoftheirpredisposingfactorsanddrugresistance

WU Yi-fei1, LIU Wei1, XIE Jie1, WU Li-min1, WANG Le1, LU Min1, SUN Ai-hua2, XIE Li1

(1.HangzhouCenterforDiseasesControlandPrevention,Hangzhou310021,China;2.HangzhouMedicalCollege,Hangzhou310053,China)

This study is aim to determine the predominant prevailing nontuberculosis mycobacteria (NTM) in Hangzhou and to understand the predisposing factors and drug resistance of NTM. PNB/TCH growth tests were used to preliminarily identify the NTM in the mycobacterium-positive culture samples from 1 972 patients. The species of NTM isolates were confirmed using mycobacterium molecular linear probe method and sequencing of PCR product of 16S rRNA gene. The influence of sex and age on predisposing factors of NTM was subsequently analyzed. Concentration proportional method was applied to detect the susceptibility of NTM isolates to armazide, rifampicin, streptomycin, ethambutol, ofloxacin and kanamycin. Results of PNB/TCH growth tests showed that 9.8% (193/1 972) of the 1 972 mycobacterium-positive culture samples were positive. The mycobacterium molecular linear probe hybridization and PCR product sequencing confirmed that in the 193 samples with positive results of PNB/TCH growth tests, 66.3%, 18.1%, 8.3% and 7.3% were infected with NTM alone, two mycobacteria,Mycobacteriumtuberculosisand bacteria that not belonging to the genus ofMycobacteria, respectively. In the 173 NTM isolates (128 with single infection and 45 with mixed infection), 57.8% were identified asMycobacteriumintracellulare, followed byMycobacteriumabscessus(12.1%),Mycobacteriumkansasii(9.8%),Mycobacteriumchelonei(9.8%) andMycobacteriumavium(5.8%). In the 35 mixed infection samples, 28.5% and 20.0% were the co-infection ofM.intracellulareandM.cheloneiwithM.tuberculosis, respectively. Male patients infected with NTM were more than female patients (1.67∶1) and the infection rate (80.4%) of populations with age over 50 years old was significantly high than that with lower than 50 years old (P<0.01). Pulmonary infection proportion (95.1%) of NTM was significantly higher than other positions of body (P<0.01). 100% of NTM isolates were resistant to armazide while the resistance rates of the isolates against the other 5 antituberculosis drugs were as high as 70.3%-90.6%. As the conclusion of this study,M.intracellulareis the predominant prevailing NTM species in the recent years in Hangzhou, NTM mainly causes pulmonary infection and middle-aged and old people are easily infected by NTM. Moreover, NTM isolates have high resistance against commonly used antituberculosis drugs.

nontuberculosis mycobacteria; isolation and identification; predominant prevalence; predisposing factors; drug resistance

Xie Li, Email: hbxieli@yeah.net

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.006

浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目(No.2012-241)资助

谢立，Email：hbxieli@yeah.net

1.杭州市疾病预防控制中心，杭州 310021；

2.杭州医学院，杭州 310053

378

A

1002-2694(2017)10-0882-06

Supported by Zhejiang Provincial Program for the Cultivation of High-level Innovative Health Talents (No.2012-241)

2017-05-03编辑李友松