饲用优良乳酸菌鉴定及生物学特性研究

李 肖，李海洋，房艳华，来航线，韦小敏，娄 义

(西北农林科技大学 资源环境学院，陕西杨凌 712100)

饲用优良乳酸菌鉴定及生物学特性研究

李 肖，李海洋，房艳华，来航线，韦小敏，娄 义

(西北农林科技大学 资源环境学院，陕西杨凌 712100)

对9株供试乳酸菌产酸产气、生长速率、产酸速率等方面筛选既能用于微生态制剂又能用于青贮饲料发酵剂的优良乳酸菌；并从细菌形态学、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析对其进行鉴定；同时进一步研究乳酸菌对温度、盐浓度和强酸强碱的耐受性、有机酸组分和药物敏感性等生物学特性。试验筛选出植物乳杆菌R02(Lactobacillusplantarum)、粪肠球菌R07(Enterococcusfaecalis)和戊糖片球菌R09(Pediococcuspentosaceus)3株优良乳酸菌。其中菌株R09生长最快，产酸能力最强，乳酸占总酸含量最高，达95.45%，可耐受0.12 g/mL NaCl；R02对温度的耐受性最强，可耐受55 ℃高温；R07对强酸强碱环境有较强的耐受能力，在pH为3.0～9.5的条件下均可生长。菌株R02、R07、R09均具有生长快、产酸和耐受能力强的优良生物学特性，因此具有应用于微生态制剂和青贮饲料的潜能。

青贮饲料；微生态制剂；乳酸菌；耐受性；药敏性

近年来，抗生素、激素、防腐剂等药物性饲料添加剂在动物饲养中过度使用，导致动物肠胃正常菌群失调，动物免疫力、抗病力下降，产生耐药性和药物残留等问题，给畜禽和人类健康带来极大的危害[1]。乳酸菌类微生态制剂具有维持肠道菌群的微生态平衡、提高营养利用率、促进营养物质的吸收、抑制致病菌侵害、增强肌体免疫功能等功效，是饲用微生态制剂中是应用最为广泛和效果较好的一类[2-4]。目前，国内外对乳酸菌的分离鉴定试验报道较多，已广泛应用于饲料工业和青贮发酵剂产品中[5-7]，但目前市场上所售菌剂的活菌数、产品有效组成和作用效果的稳定性都存在很多问题，国内研究人员大多对乳酸菌在青贮发酵过程中发挥的作用进行探讨[4]，但其机理机制还有待进一步深入探究。筛选出能够旺盛繁殖、以乳酸为单一发酵产物，对环境条件有良好耐受能力的乳酸菌是益生菌研究的关键问题，决定着乳酸菌类发酵剂的使用效果[8]。

本研究以近年来西北农林科技大学资源与环境学院微生物生态研究室保存的9株乳酸菌为供试菌株，从发酵类型(产酸产气特性)、生长速率、产酸速率等方面筛选优良乳酸菌，通过形态学、生理生化和分子生物学方法对其进行鉴定，并对乳酸菌的耐酸耐碱性、有机酸组分和药物敏感性等生物学特性进行研究。筛选出具有应用于微生态制剂和青贮饲料潜能的优良乳酸菌，为开发相应产品提供理论基础和优良的出发菌株。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 供试9株乳酸菌Lactobacilluscasei(R01)、Lactobacillusplantarum(R02)、Lactobacillusfermentum(R03)、Lactobacillusparaplantarum(R04)、Lactobacilluspentosus(R05)、Enterococcusdurans(R06)、Enterococcusfaecalis(R07)、Lactobacillusbuchneri(R08)、Pediococcuspentosaceus(R09)(CGMCC12487)均为西北农林科技大学资源环境学院微生物生态研究室多年分离并保存的菌株。

1.1.2 培养基[9]MRS琼脂培养基：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、牛肉膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.05 g、吐温801.0 mL、琼脂20.0 g、蒸馏水1 000 mL。

SL培养基：酪蛋白水解物10 g、酵母提取物5 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠25 g、硫酸镁0.58 g、琼脂15 g、葡萄糖20 g、吐温801.0 mL、磷酸氢二钾6 g、硫酸亚铁 0.03 g、硫酸锰 0.15 g、蒸馏水1 000 mL。

PY基础培养基：蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，胰酶解酪胨0.5 g，盐溶液4.0 mL，蒸馏水1 000 mL。

盐溶液成分：氯化钙0.2 g，硫酸镁0.48 g，磷酸氢二钾1.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，碳酸氢钠10.0 g，氯化钠2.0 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方 法

1.2.1 乳酸菌的纯化[9]以含有20 g/L CaCO3的SL培养基和MRS琼脂培养基，采用平板稀释法进行培养、纯化，观察其菌落和个体形态。接种到MRS斜面培养基上，37 ℃恒温微好氧条件下培养48 h后置于4 ℃冰箱中保存，备用。

1.2.2 优良乳酸菌的筛选 葡萄糖产酸产气实验[10]： PY基础培养基内加入30 g/L葡萄糖和0.5 mL/L吐温80以16 g/L质量浓度的溴甲酚紫作指示剂，分装至试管，在试管内倒置一杜氏试管，121 ℃灭菌20～30 min，接菌后置于37 ℃恒温培养箱培养24 h。

产酸速率[11]：按1×107mL-1的接种量将供试的产酸不产气同型发酵乳酸菌接入100 mL pH为6.5的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养。每2 h采用DELTA - 320 pH计测定各菌株发酵液的pH，绘制各发酵时间段所对应的发酵液pH的变化曲线，即为产酸速率曲线。

生长曲线[11]： 按1×107mL-1的接种量将供试的同型发酵乳酸菌接入100 mL MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养36 h。每2 h取样1次，以不接菌为对照，采用菌落平板计数法测定样品的活菌数，以培养时间为横坐标，相对应的活菌数为纵坐标，绘制乳酸菌生长曲线。

1.2.3 优良乳酸菌的鉴定[9]形态学鉴定：将菌株分别涂布在MRS固体培养基上，37 ℃培养1～2 d，观察菌落特征，革兰氏染色和菌体形态参照程丽娟等[10]的方法。

生理生化鉴定：石蕊牛奶、淀粉水解、精氨酸水解、精氨酸产氨、明胶液化、产硫化氢、马尿酸盐水解、葡聚糖产生、V-P试验以及菌株对D-果糖、葡萄糖、D(+)麦芽糖、D(+)甘露糖、D-甘露醇、蔗糖、木糖等二十种碳水化合物发酵产酸试验参照凌代文等[9]的方法。

16S rDNA序列分析：供试乳酸菌基因组DNA的提取及PCR扩增16S rDNA参照凌代文等[9]的方法。

PCR扩增使用的引物对为：

PA：5′-CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

PB：5′-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′

16S rDNA序列同源比对及进化树的构建参照李丽[12]的方法。

1.2.4 优良乳酸菌生物学特性研究 耐受性试验[13]：将活化的乳酸菌按φ=6%接种量接入MRS液体培养基后分别置于4、10、20、28、37、45、55 ℃培养24 h，采用菌落平板计数法测定各组菌液的活菌数，进行温度耐受性分析；用无菌HCl和NaOH调节MRS液体培养基pH至3.0、4.0、5.0、6.5、8.0、9.0、9.5，接种培养24 h，测定各组菌液的活菌数，进行酸碱耐受性分析；用NaCl调节MRS液体培养基的盐质量浓度为0、0.015、0.03、0.04、0.065、0.08、0.12 g/mL接种培养24 h，测定各组菌液的活菌数，进行耐盐性分析。

有机酸测定[14]：通过高效液相色谱法进行乳酸菌发酵液产酸组分的测定。将3株乳酸菌的发酵液在3 000 r/min离心30 min，将上清液经0.45 μm 的微孔滤膜过滤后，测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的质量分数。流动相为w=0.5%(NH4)2HPO4(用磷酸调pH为2.55)，流速为2 mL/min；色谱柱为C18，柱温35 ℃，检测波长UV 214 nm。

药敏性试验[15]：挑取少许R02、R07和R09制成菌悬液，均匀涂布于MRS平板培养基上，将四环素、氯霉素、红霉素、复方新诺明、先锋噻肟、氟哌酸、氟嗪酸、痢特灵、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、万古霉素、氨苄青霉素、青霉素 G、先锋 V 和利福平共16种药敏片置于平板上，同时设置生长对照和标准菌株的阳性对照，35 ℃培养24 h，观察并记录抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 优良乳酸菌的筛选

2.1.1 葡萄糖发酵产酸产气分析 以R01、R02、R03、R04、R05、R06、R07、R08、R09为供试菌株，进行葡萄糖发酵产酸产气分析，培养基的颜色由紫色变为黄色表示产酸，由颜色深浅可判断菌株产酸能力的强弱，结果见表1。测定结果显示9株菌株均产酸，但产酸能力差异较大，R02、R03、R05、R07、R09产酸能力较强，R01、R04、R08次之，R06较差。菌株R03、R04、R05在产酸的同时，培养基中杜氏试管顶端出现气泡，表明其产气，为异型发酵乳酸菌，其他菌株产酸的同时未产气，为同型发酵乳酸菌。

表1 供试菌株发酵葡萄糖产酸产气Table 1 The results of acid and gas production from glucose fermented by the tested strains

注：“-”表示不能够产酸或产气；“+” “++” “ +++” 表示产酸或产气能力依次增强。

Note：“-”denotes no acid or gas production; “+” “++” “+++”denotes the ability of acid or gas production enhanced gradully.

2.1.2 生长曲线及产酸速率曲线 选取产酸能力强的同型发酵乳酸菌(R01、R02、R07、R08、R09)进行生长速率和产酸速率测定，其生长曲线和产酸速率曲线分别见图1和图2。由图1可知，5株乳酸菌生长均呈现标准的S型曲线，菌株生长包括适应期、对数期和稳定期。菌株R01、R07和R09的适应期较长，曲线较平缓，6 h以后进入对数期，菌株R02和R08的适应期较短，且在适应期内有缓慢的生长；菌株R02和R09的对数期最短，菌体迅速繁殖，16 h以后进入稳定期，菌株R01和R07在对数期菌体生长速率较R02和R09缓慢，20 h以后进入稳定期，菌株R01在稳定期菌数量较低，R08对数期最长，且生长缓慢。结果表明，R02、R07和R09 3株菌生长性能较好。

图1 同型发酵乳酸菌的生长曲线Fig.1 Growth curve of homo-fermentative lactobacillus

由图2可以看出，各菌株在培养过程中pH的变化规律基本一致，pH都呈现先稳定后下降再稳定的趋势。结合生长曲线的测定结果，乳酸菌处于适应期时，培养基中pH变化基本保持稳定；当生长进入对数期，菌体大量繁殖，pH呈现迅速下降的趋势；生长进入稳定期时，代谢减慢，pH又趋于稳定。虽然各个菌株在培养期间，pH都明显下降，但菌株的产酸速率和能力存在明显差异。R02和R07在对数生长期时pH下降速度最快，R01和R09次之，R08下降速度缓慢。由图2可知，R02和R07产酸速率快，且pH下降幅度最大，R01和R09次之。

综合同型发酵乳酸菌的生长曲线和产酸速率的结果得出：R02、R07和R09 3株菌生长性能和产酸能力均较好，可用于后续研究及应用。

图2 同型发酵乳酸菌的产酸速率Fig.2 Rate of acid production of homo-fermentative lactobacillus

2.2 优良乳酸菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定 筛选获得的3株优良乳酸菌在MRS平板培养的菌落特征和菌体的形态特征见图3及表2。3株菌均为革兰氏阳性、接触酶阴性的同型发酵乳酸菌，菌株R02为杆状菌，菌株R07和R09为球状菌。

2.2.2 生理生化鉴定结果 对筛选出的3株无芽孢、革兰氏阳性、接触酶阴性乳酸菌R02、R07和R09进行碳源利用方式及生理生化指标鉴定，结果见表3。 R02、R07和R09菌株均不具备水解淀粉、还原硝酸盐和产生H2S的能力，无运动性，耐酸性能好。依据形态和培养特征，结合菌株对碳源的利用方式，初步判断R02属于乳杆菌属， R07属于链球菌属，R09属于片球菌属。

图3 R02、R07和R09的革兰氏染色及菌落形态照片Fig.3 Gram staining and colony morphology of R02, R07 and R09 strains

表2 R02、R07和R09的特性Table 2 Characteristics of R02, R07 and R09 strains

2.2.3 分子生物学鉴定 经16S rDNA序列同源比对构建的进化树见图4。R02与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)亲缘关系最近，R07与粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)亲源关系最近，R09与戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)亲缘关系最近。因此，结合3株菌的形态特征、生理生化和16S rDNA比对结果鉴定R02为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)；R07为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)；R09为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

2.3 优良乳酸菌生物学特性研究

2.3.1 耐受性试验结果 由图5可知，3株菌的最适培养温度均为37 ℃，R02菌株对低温和高温均有较强的耐受能力，在培养温度达到55 ℃时仍可生长，R07和R09菌株对温度较为敏感，温度高于45 ℃时菌株生长微弱。由图6可知，各菌株的生长随着NaCl质量浓度的增高而减弱，R09菌株在NaCl质量浓度0.12 g/mL时仍可良好生长，说明R09菌株具有很强的耐盐能力，R02和R07次之，其在NaCl质量浓度高于0.03 g/mL后生长性能显著减弱。由图7可知，pH对乳酸菌的影响较大，各菌株在pH为6.5时菌数最大，为各菌株的最佳培养条件。R09菌株在pH为9时生长较好，说明R09对强碱环境有一定的耐受能力，R02和R07次之。

2.3.2 有机酸组分测定 通过高效液相色谱仪对乳酸菌发酵产酸情况进行酸组分分析，结果见表4。3菌株经液体发酵后均产生乳酸和少量丙酸，无乙酸和丁酸产生，3株菌产乳酸均超过85%，其中R09和R02达95%以上。说明R02、R07和R09这3株菌在生产上具有良好的潜能。

表3 R02、R07和R09的生理生化鉴定结果Table 3 The physiological and biochemical characteristics result of R02, R07 and R09 strains

注：+ 表示结果呈阳性；++ 表示结果呈较强阳性；+++ 表示结果呈强阳性；- 表示结果呈阴性。

Note：+ denotes positive, ++ denotes stronger positive；+++ denotes strongest positive;- denotes negative.

图4 菌株R02、R07和R09的系统进化树Fig.4 Evolutionary tree of R02, R07 and R09 strains

不同字母表示差异显著(Plt;0.05)。下同。

The different letter in the same column are significantly different(Plt;0.05).The same below.

图5不同温度下培养乳酸菌24h后的活菌数
Fig.5Viablebacterialcellcountoflactobacillusculturedatdifferenttemperaturefor24h

图6 不同NaCl质量浓度培养乳酸 菌24 h后的活菌数Fig.6 Viable bacterial cell count of lactobacillus cultured at different NaCl mass concentration for 24 h

2.3.3 耐药性试验结果分析 采用纸片扩散法进行试验，结果以美国 NCCLS 文件为判断标准(表5)。

图7 不同pH培养乳酸菌24 h后的活菌数Fig.7 Viable bacterial cell count of lactobacillus cultured at different pH values for 24 h

从表 5可以看出，在对抗生素类、氟喹诺酮类、磺胺类、呋喃类、喹恶啉类等5类抗菌药物的药敏性试验中，3株菌对大多数药物具有较强的耐受性，其中菌株R09对所有抗菌药物都具有很强的耐药性，菌株R07仅对四环素、氯霉素、万古霉素、氨苄青霉素、先锋V和利福平6种药物敏感，R02菌株的耐药性相对较弱，因此在用于动物防病治病时应注意避免将R02和R07菌株与少数敏感性抗生素同时使用。

3 讨 论

目前，国内外对乳酸菌作为青贮饲料发酵剂或微生态制剂的研究非常广泛[16-20]，但对于高效稳定的乳酸菌菌株的筛选和研究仍十分迫切。本试验从生长性能、产酸性能和耐受性等方面出发，共筛选获得3株同型发酵乳酸菌。与传统的鉴定手段相比，本研究先从形态学特征和生理生化特性出发，对3株菌做初步鉴定，然后通过16S rDNA 序列分析方法进一步鉴定，提高了鉴定的准确率。结果表明，R02为植物乳杆菌，R07为粪肠球菌，R09为戊糖片球菌。

表4 有机酸质量分数Table 4 Mass fraction of organic acids

注：不同字母表示差异显著(Plt;0.05)。

Note：The different letter in the same column are significantly different(Plt;0.05).

表5 R02、R07和R09的药敏性试验结果Table 5 The result of antibiotic susceptibility test of R02, R07 and R09 strains

注：R表示耐药；I表示中敏感；S表示敏感。

Note：R denotes resistance; I denotes intermediary ; S denotes sensitive.

乳酸菌作为微生态制剂以及饲料发酵剂直接作用于动物肠道，能产生大量有机酸类物质，并可在动物肠道中形成一层菌膜，有效地抵抗病毒和病原微生物的侵袭，增强生物体对疾病的抵抗力[17-18]，可部分替代抗生素在畜牧业养殖中的使用。乳酸菌对温度、pH值和盐浓度的耐受性有效抑制了微生态制剂生产过程中活菌量的降低，也提高了乳酸菌进入动物肠道的定植能力；对抗菌药物的耐受性能够增强机体的免疫机能、防病治病、提高生产效益。本试验研究结果表明，3株菌对温度、pH和盐浓度都具有较强的耐受能力，其中，R09可耐受0.12 g/mL的NaCl；R02可耐受55 ℃的高温环境；R07在pH为3.0～9.5的条件下均可生长。另外，在对常用抗生素的耐受性方面，菌株R02和R07对抗菌药物表现出较强的耐受性，而R09表现出极强的耐药性，为微生态制剂开发提供优良的菌株。

在青贮饲料的发酵过程中应用乳酸菌发酵剂可以迅速降低青贮物料的pH至3.8～4.2，抑制有害菌的生长，提高乳酸/乙酸的比例及饲料适口性，降低蛋白质的分解率，提高干物质的回收率，从而实现长期保存饲料及其营养物质的目的[19-22]。用于青贮发酵的乳酸菌应具有均一的发酵途径，可快速发酵乳糖产生大量乳酸，因此作为饲料添加剂的乳酸菌的产酸能力、产酸速度以及产乳酸的比例直接影响青贮品质。3株乳酸菌发酵24 h后的pH分别为3.62、3.63和3.77，且乳酸质量分数均超过85%，其中菌株R02和R09的乳酸质量分数超过95%，因此，3株菌均具有青贮的潜能。

综上，本试验筛选出3株优良的同型发酵乳酸菌，均具有良好的产酸能力和抗逆性，并对常用抗菌药物有很强的耐受能力和良好的生物学特性，为青贮饲料发酵剂和微生态制剂的制备提供优良的出发菌株。

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CorrespondingauthorLAI Hangxian,male,associate professor,doctoral supervisor.Research area:microbial resources and utilization. E-mail:laihangxian @163.com

(责任编辑：史亚歌Responsibleeditor:SHIYage)

ScreeningandCharacteristicsofExcellentLacticAcidBacteriaforSilageAdditiveandProbiotics

LI Xiao, LI Haiyang, FANG Yanhua, LAI Hangxian, WEI Xiaomin and LOU Yi

(College of Resource and Environment Science, Northwest Aamp;F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

The study was conducted to screen the excellent lactic acid bacteria for both silage additive and probiotics based on acid and biogas yield tests, growth rate and rates of acid producing tests, and the isolated strains were identified by morphological observation, physiological and biochemical tests, and sequence analysis of the 16S rDNA gene. Furthermore, other biological characteristics of excellent lactic acid bacteria, such as salt, acid and alkalis solvent tolerance, temperature resistance, the organic acid of lactic acid bacteria fermenting liquid composition and drug sensitivity were investigated. The result showed that three strains of lactic acid bacteria ,R02(Lactobacillusplantarum), R07(Enterococcusfaecalis) and R09(Pediococcuspentosaceus) were screened. R09 has the fastest growth rate and the strongest ability of producing acid. The proportion of lactic acid is the highest in liquid cultures of R09, accounting for 95.45% of the total acid content. Additionally, R09 can survive in 0.12 g/mL NaCl solution. R02 has the strongest tolerance to temperature, which grows well below 55 ℃. R07 has a strong resistance to acid and alkali, which can grow and survive within a wide pH range(3.0 to 9.5). R02, R07 and R09 strains characterized with such as high acids-producing capacity and high tolerance to acid, have a potentiality of using as silage additive and probioties.

Silage; Probiotics; Lactic acid bacteria; Tolerance; Antibiotic susceptibility test

2016-12-20

2017-01-18

Projects in the National Science amp; Technology Pillar Program During the Twelfth Five-Year Plan Period(No.2012BAD14B11).

LI Xiao, female,master student.Research area:microbial resources and utilization.E-mail:xiaolivjiayou@sina.com

日期：2017-11-17

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171117.1101.024.html

2016-12-20

2017-01-18

“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD14B11)。

李 肖，女，硕士研究生，研究方向为微生物资源与利用。E-mail:xiaolivjiayou@sina.com

来航线，男，副教授，博士生导师，研究方向为微生物资源与利用。E-mail:laihangxian@163.com

Q939.96

A

1004-1389(2017)11-1655-09