姜黄素对淋巴瘤细胞VEGF表达的影响

朱红波 周 丽

(泰山医学院附属医院血液内科，山东 泰安 271000)

姜黄素对淋巴瘤细胞VEGF表达的影响

朱红波 周 丽

(泰山医学院附属医院血液内科，山东 泰安 271000)

目的 探讨抑制血管新生药物姜黄素对人伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞体外生长影响及血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的影响，为淋巴瘤治疗新途径抗血管生成提供理论依据。方法 相差显微镜观察不同浓度(10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)姜黄素作用于Raji细胞后24 h后细胞形态，ELISA法检测培养上清VEGF水平。结果 姜黄素对 Raji 细胞增殖有明显的抑制作用，抑制程度与浓度正相关。不同浓度姜黄素作用Raji细胞24 h后，10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L姜黄素处理组VEGF浓度分别为(369.73±14.22)pg/ml、(178.24±21.18)pg/ml、(51.41±9.68)pg/ml，与对照组相比均显著降低(Plt;0.05)。结论 姜黄素能够抑制Raji细胞增殖及VEGF的分泌，其抑制作用具有浓度依赖性，提示姜黄素对Raji细胞株血管新生有抑制作用，为抗血管新生药物用于治疗淋巴瘤提供依据。

姜黄素；Raji细胞株；血管内皮生长因子

姜黄素是一种多酚类物质，是姜黄的主要活性成分。姜黄素具有广泛的药用价值：抗炎、清除氧自由基、抗突变和抗肿瘤等[1-3]。近年来，相关实验证实姜黄素具有确切的抗肿瘤活性，其中抑制肿瘤血管新生是姜黄素抗肿瘤作用的主要机制之一。本研究采用不同浓度姜黄素作为血管新生抑制剂，观察对Raji细胞VEGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1细胞株、细胞培养

人伯基特淋巴瘤Raji细胞株购自于南京凯基生物科技发展公司。将细胞于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中进行接种，5%CO2浓度和37 ℃饱和湿度培养箱中进行培养。待细胞生长至合适阶段，进行传代培养。取处于对数生长期的细胞进行试验。

1.2主要试剂及配制

姜黄素(Sigma公司)，纯度99%。不同浓度姜黄素配置方法：称取姜黄素18.42 mg，加入到10 ml DMSO中使之溶解，此时姜黄素浓度为5000 μmol/L。分装并于-20 ℃冷冻保存。临用前解冻并加入到培养液使姜黄素稀释到所需浓度10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L。(预实验显示终浓度为1‰的DMSO不影响 Raji 细胞的生长)。VEGF-ELISA试剂盒(Ramp;D公司)。

1.3实验相关分组

阴性对照组：Raji细胞培养液中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液。姜黄素处理组：Raji细胞培养液中加入DMSO溶解的姜黄素，将最终浓度分别调整为10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L。

1.4显微镜下观察细胞大小、形态

收集处于对数生长期的Raji细胞，将细胞浓度调整为2×105/ml，加于24孔培养板，实验组使用不同浓度姜黄素(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)处理，同时设立阴性对照组。分别于37 ℃培养 24 h后，使用倒置相差显微镜观察并照相。

1.5ELISA法测定不同浓度姜黄素处理后上清液中VEGF含量

收集处于对数生长期的Raji细胞，把细胞浓度调整为1×106/ml，加于96孔板，实验组加入不同浓度姜黄素(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)，每组设6个平行孔，另外，同时设立阴性对照组。培养24 h后，收集培养上清液，按照VEGF的ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.6统计学方法

2 结 果

2.1姜黄素对Raji细胞增殖及形态的影响观察

使用倒置相差显微镜，观察培养24 h后姜黄素处理组(10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)和阴性对照组Raji细胞生长情况。结果显示：阴性对照组Raji细胞为圆形、折光性强、成团生长、大小较一致。而经过姜黄素处理的Raji细胞，细胞团体积较对照组减小、分散生长，细胞大小不一、部分细胞膜破裂、可见细胞碎片，同时折光性减弱，以50 μmol/L姜黄素组最为明显(见图1～4)。

图1 阴性对照

图2 姜黄素处理组(10 μmol/L)

图3 姜黄素处理组(25 μmol/L)

图4 姜黄素处理组(50μmol/L)

2.2姜黄素对Raji细胞VEGF表达水平的影响

应用ELISA试剂盒检测姜黄素对Raji细胞VEGF表达水平的影响，发现经10 μmol/L、25 μmol/L以及50 μmol/L浓度姜黄素后VEGF表达水平分别为(369.73±14.22)pg/ml、(178.24±21.18)pg/ml和(51.41±9.68)pg/ml。与对照组相比，VEGF表达水平均显著性降低(Plt;0.05)；随姜黄素浓度的增加，VEGF表达水平逐渐降低，不同浓度处理后VEGF表达水平的差异具有统计学意义(Plt;0.05)(表1)。

表1 姜黄素对Raji细胞VEGF表达水平的影响

注：*与正常对照组相比较，△不同浓度姜黄素组间比较。

3 讨 论

研究发现，姜黄素缺氧诱导因子 (HIF-1α)、VEGF、血管内皮生长因子受体 (VEGFR-1)和环氧合酶因子 (COX2) 的表达可诱导肿瘤细胞凋亡[4-6]。姜黄素通过其抗血管新生的作用，对肿瘤细胞的增殖、扩散均有抑制作用，具有体内外抗肿瘤细胞活性。Arbiser JL等[7]发现，姜黄素及其衍生物可以抑制内皮细胞增生和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的小鼠角膜新生血管的形成。本研究发现，姜黄素处理Raji细胞后，Raji细胞的增殖明显受到抑制、VEGF表达水平显著降低，提示姜黄素可能通过抑制VEGF的表达从而抑制淋巴瘤细胞的增殖、迁移从而发挥其抗肿瘤作用。

B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤约占淋巴系统肿瘤的2/3。尽管化疗、自体造血干细胞移植、干扰素、细胞治疗等方法被广泛用于B细胞性非霍奇金淋巴瘤的治疗，但是副作用较大、患者长期耐受性较差，且肿瘤的完全缓解率及长期生存都不理想。姜黄素的药理活性广泛、安全性好、不良反应小[8]，并可有效降低VEGF的表达，对Raji细胞的增殖也有较强的抑制作用，提示其可以作为治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的新型药物，为肿瘤治疗开辟新的途径。

[1] Darvesh A S,Aggarwal B B,Bishayee A. Curcumin and liver cancer:a review[J].Curr Pharm Biotechnol,2012,13:218-228.

[2] Almanaa TN, Geusz ME, Jamasbi RJ. Effects of curcumin on stem-like cells in human esophageal squamous carcinoma cell lines[J].BMC Complement Altern Med, 2012, 24，12(1):195.

[3] Qiao Q, Jiang Y, Li G. Curcumin enhances the response of non-Hodgkin's lymphoma cells to ionizing radiation through further induction of cell cycle arrest at the G2/M phase and inhibition of mTOR phosphorylation[J].Oncol Rep, 2013,29(1):380-386.

[4] Lev-Ari S,Starr A,Katzburg S,et al.Curcumin induces apoptosis and inhibits growgh of orthotopic human non-small cell lung cancer xenografts[J].J Nutr Biochem,2014,25(8):843-850.

[5] Nagaraju GP，Aliya S，Zafar SF，et al. The impact of curcumin on breast cancer .Integr Biol (Camb)[J]. 2012,4(9):996-1007.

[6] Wang L,Ye X,Cal X,et al. Curcumin suppresses cell growth and invasion and induces apoptosis by down-regulationg do Skp2 pathway in glioma cells[J].Oncotarget,2015,6(20):18027-18037.

[7] Arbiser JL,Klauber N,Rohan R, et al. Curcumin is an in vivo inhibitor of angiogenesis[J]. Mol Med,1998,4(6):376-383.

[8] 郑加荔,言君凯,蔡美琴.姜黄素抗肿瘤作用的研究进展[J].中华临床营养杂志，2009,8(17):251-256.

Effects of curcumin on VEGF expression in lyphomacells

ZHU Hong-bo ZHOU Li

(Dept.of Hematology,Affiliated Hospital of Taishan Medical University, Taian 271000,China)

Objective:To investigate the effect of curcumin on growth and VEGF expression of human Burkitt lymphoma cell. Methods:The effect of curcumin in different concentrations (10 μmol/L, 25 μmol/L and 50 μmol/L) on proliferation of Raji cells at 24 hours was observed by phase contrast microscope. The expression of VEGF was examined using ELISA in the curcumin-treated and untreated Raji cells. Results:Curcumin inhibited the proliferation of Raji cells at concentrations of 10 μmol/L, 25 μmol/L and 50 μmol/L. The concentrations of VEGF in cultured supernatants of Raji cells were (369.73±14.22) pg/ml, (178.24±21.18)pg/ml, and (51.41±9.68)pg/ml, respectively. The VEGF concentration was significantly lower than that in the control group. Conclusion:Curcumin inhibits the proliferation of Raji cells and down-regulates the expression of VEGF. Curcumin is a potential inhibitor of B cell lymphoma.

curcumin;Raji cell line;vascular endothelial growth factor

R552

A

1004-7115(2017)11-1212-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.11.004

朱红波(1979—)，女，山东泰安人，主治医师，硕士，主要从事临床血液内科工作。

周丽，主任医师，研究生导师，E-mail：lizhou1955@yahoo.com.cn。

2017-08-02)