稳定敲低PLEKHQ1基因细胞株的建立*

周晨辰 陆 琤 张鹏飞 张 硌*

稳定敲低PLEKHQ1基因细胞株的建立*

周晨辰①陆 琤①张鹏飞①张 硌①*

目的：建立稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株。方法：在293TX细胞中进行病毒的包装，用获得的高滴度慢病毒感染RAW和THP-1细胞，通过免疫印迹和荧光显微镜，检测病毒感染后RAW和THP-1细胞PLEKHQ1蛋白表达的变化。结果：PLEKHQ1-lentiviral shRNA-1质粒在转染后表现出明显的干扰作用，感染后能明显下调RAW和THP-1细胞的PLEKHQ1蛋白表达。结论：稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株的建立，可为进一步研究PLEKHQ1在相关疾病中的功能奠定基础。

PLEKHQ1基因；RAW细胞株；慢病毒感染

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，由单核细胞或其他前体细胞分化而来，因此通常将单核细胞和巨噬细胞统称为单核巨噬系统(mononuclear phagocyte system，MPS)[1-2]。作为机体“第一道防线”的巨噬细胞，是一类多重功能的免疫细胞，其既是先天免疫的主要“执行者”，又参与启动适应性免疫反应。随着研究的深入，巨噬细胞在免疫调节、创伤修复、组织重塑、血管发生、肿瘤侵袭和体温调控等过程中的作用不断被发现[3-6]。巨噬细胞相关的研究引起了学术界的极大关注。

PLEKHQ1(pleckstrin homology domain containing， family Q member 1)是一种包含490个氨基酸的蛋白质[7-8]。目前为止，尚无文献专门对其功能进行报道。因此，本研究为进一步研究PLEKHQ1的特性，选用巨噬细胞RAW和单核细胞THP-1细胞作为目标细胞株，利用慢病毒感染体系，体外包装病毒后对细胞进行病毒感染，并结合嘌呤霉素筛选以及流式细胞仪筛选的方法建立稳定敲低PLEKHQ1的RAW和THP-1细胞株，为进一步研究PLEKHQ1在相关疾病中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

(1)Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；离心过滤器购自德国Millipore公司；Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)。

(2)包装质粒PMD、SPA、表达载体PLEKHQ1-lentiviral shRNA-1、control shRNA质粒、293TX细胞和RAW和THP-1细胞为本室保存。嘌呤霉素(puromycin)，PLEKHQ1抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化酶标记二抗购自美国Jackson ImmunoResearch公司；ECL显影试剂购于美国Thermo公司；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；血清购自美国Hyclone公司。蛋白质转印NC膜购自美国Pall公司。

1.2 细胞培养

采用293TX、RAW和THP-1细胞：将细胞培养皿或培养瓶置于37 ℃的5%CO2细胞培养箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。

1.3 慢病毒感染

1.3.1 病毒包装

293TX包装细胞培养在含双抗和10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI1640培养基中，于细胞对数生长期时接种，接种后用不加抗生素的培养基培养。实验中的干涉序列为PLEKHQ1-lentiviral shRNA#1(5-ACAAGGTCAGTGACATCAA-3)，control shRNA (5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3)。接种于60 mm×15 mm的培养皿，总质粒转染量为9 μg，分别为包装质粒PMD 1.5 μg，SPA 3 μg，表达载体PLEKHQ1-lentiviral shRNA-1 4.5 μg。转染后8 h或过夜更换无抗生素培养基，然后36～48 h再补充5 ml无抗生素培养基。转染后72 h收上清，0.22 μm滤器过滤。为提高病毒滴度，可用规格为10 K的离心过滤器以4000 r/min离心20 min浓缩含病毒的上清。浓缩后置于-4 ℃保存，隔天或立刻使用[9]。

1.3.2 RAW细胞的感染及筛选

待感染的RAW和THP-1细胞对数生长期时接种至6孔板中，接种细胞时感染，将浓缩后的病毒全部加入培养皿中。RAW细胞极易存活，因此感染细胞的细胞数量为单个或数个细胞为宜，而感染THP-1细胞的密度为5 d后长满为宜。4～5 d可看见部分细胞发绿色荧光。此时RAW细胞使用嘌呤霉素5 μg/ml处理24 h，然后换为新鲜的完全培养基以促进细胞生长。THP-1细胞为悬浮细胞，无法通过嘌呤霉素筛选，因此采用流式细胞仪筛选分离获得。

1.4 免疫印迹检测

细胞用放射免疫沉淀分析(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液[50 mmol/L Tris(pH值 7.4)，150 mmol/L的NaCl溶液，1% NP-40，0.1%的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)]，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂裂解，SDS-PAGE电泳分离蛋白后电转移至NC膜。脱脂牛奶封闭液封闭1 h。加入一抗，室温温育2 h或4 ℃温育过夜。用三羟甲基氨基甲烷盐吐温(tris buffered saline tween，TBST)缓冲液洗膜3次，每次10 min。加入相应的二抗，室温温育1 h。再用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。将增强化学发光(enhanced chemi luminescence，ECL)显色液加到膜上，用保鲜膜将膜包起来后放入Tanon 5200化学发光成像分析系统中曝光、显影，并保存数据。

1.5 显微镜观察

感染的RAW和THP-1细胞长到4～5 d后，取出在倒置荧光显微镜下观察其形态变化。且在激发光(450～490 nm蓝光波长)照射下，观察RAW和THP-1细胞感染情况，判定其感染率。

2 实验结果

2.1 PLEKHQ1基因蛋白表达水平的检测

RAW和THP-1细胞分别感染对照病毒和PLEKHQ1干扰病毒，经嘌呤霉素筛选，培养传代后收细胞进行Western印迹检测。与shRNA感染的细胞相比，PLEKHQ1干扰病毒感染的RAW和THP-1细胞其PLEKHQ1的蛋白表达水平明显降低，在PLEKHQ1-lentiviral shRNA-1感染后的RAW和THP-1细胞中PLEKHQ1几乎不表达，表明稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株已经建立成功(如图1所示)。

图1 免疫印迹检测RAW和THP-1细胞株中PLEKHQ1表达示图

图中shRNA为control shRNA感染的细胞；sh1为PLEKHQ1-lentiviral shRNA#1感染的细胞。

2.2 PLEKHQ1敲低后对COS-7细胞形态的影响

构建的慢病毒表达载体导入细胞后能够表达具有绿色荧光蛋白特征的融合蛋白，在激发光照射下产生稳定的绿色荧光[10]。用其感染RAW和THP-1细胞4～5 d后则可见绿色荧光蛋白的表达，细胞外观形态显示，病毒感染前后RAW和THP-1细胞株形态无明显改变，因此PLEKHQ1的敲低对RAW和THP-1细胞株形态无显著影响(如图2所示)。

图2 荧光显微镜观察PLEKHQ1敲低后对RAW和THP-1细胞形态的影响示图

图中control为control shRNA感染的细胞；sh1为PLEKHQ1-lentiviral shRNA#1感染的细胞。

3 结论

PLEKHQ1又被称为PLEKHO2(pleckstrin homology domain containing， family O member 2)，结构上其N端含有一个PH结构域(Pleckstrin Homolgy Domain)，PH结构域负责形成蛋白-蛋白和蛋白-脂质之间的相互作用，并包含一个氯离子通道结构域[11-13]。在人体内，编码PLEKHQ的基因位于15号染色体上[13-15]。到目前为止，尚无任何文献专门对其功能进行报道。本研究前期进行的生物信息学分析显示，PLEKHQ1可能参与细胞因子与受体的相互作用，其PH结构域可以结合磷脂。表达谱数据显示其在巨噬细胞中特异性高表达，表示PLEKHQ1可能在巨噬细胞功能调控中发挥作用。因此，建立稳定敲低PLEKHQ1的巨噬细胞和单核细胞细胞株对后续PLEKHQ1生物学功能的基础研究具有重要意义。

本研究以RAW和THP-1细胞株为研究对象，通过慢病毒介导的方法，获得了稳定敲低PLEKHQ1基因的RAW和THP-1细胞株。结果显示，RAW和THP-1细胞株中PLEKHQ1的表达能力得到了有效抑制。

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Establishment of stable RAW and THP-1 cell strain with PLEKHQ1-knock-down

ZHOU Chenchen, LU Cheng, ZHANG Peng-fei, et al

Objective:To establish RAW and THP-1cell strain which PLEKHQ1 gene was stably knocked down.Methods:The lentiviral plasmids was transfected into 293TX cells to achieve package. And then the packaged lentivirus of high titer were used to infect RAW and THP-1 cell. Western blot and Fluorescence microscope were applied to detect and analyze the change of expression of PLEKHQ1protein after RAW and THP-1 cell was infected by lentivirus.Results:PLEKHQ1-lentiviral shRNA1 showed significant interference effect after it was transfected, and can obviously reduced expression of PLEKHQ1 in RAW and THP-1cells.Conclusion:The establishment of RAW and THP-1 cell strain with PLEKHQ1 knock-down can lay a foundation for further researching the function of PLEKHQ1 in relevant disease.

PLEKHQ1 gene; RAW cell strain; Lentivirus transfection

Department of Medical Engineering, The 307thHospital of PLA, Beijing 100071, China.

1672-8270(2017)11-0140-03

R-33

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.11.041

周晨辰,女,(1988- ),硕士，助理工程师。解放军第307医院医学工程科，从事基因功能研究工作。

国家自然科学基金(31400739)“PH结构域蛋白PLEKHQ1协调巨噬细胞迁移与激活的机制研究”；军事医学创新基金(2015CXJJ29)“PLEKHQ1调控细菌性脓毒败血症的功能和机制研究”

①解放军第307医院医学工程科 北京 100071

*通讯作者：marbleluo@126.com

China Medical Equipment,2017,14(11):140-142.

2017-06-07