头孢曲松钠对大鼠脑损伤后海马神经细胞凋亡的影响

李 萍 李月红 孟伶俐 周洪霞

(唐山工人医院功能检验科，河北 唐山 063000)

头孢曲松钠对大鼠脑损伤后海马神经细胞凋亡的影响

李 萍 李月红 孟伶俐 周洪霞1

(唐山工人医院功能检验科，河北 唐山 063000)

目的探讨头孢曲松钠对脑损伤大鼠学习记忆及神经细胞凋亡的影响。方法选用SPF级SD大鼠，随机分为假手术组、脑损伤组、治疗组。采用液压冲击法制备脑损伤模型，治疗组于致伤前5 d注射头孢曲松钠(200 mg/kg)，连续5 d。通过Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力，干湿比重法检测脑组织含水量，免疫组织化学法及Western印迹法检测caspase-3和caspase-9蛋白表达水平。结果与脑损伤组比较，治疗组明显增强液压冲击性脑损伤的空间学习记忆能力(Plt;0.05)，减轻脑组织含水量(Plt;0.05)，下调凋亡相关蛋白caspase-3 和caspase-9蛋白表达(Plt;0.05)。结论头孢曲松钠治疗可以通过减轻海马神经细胞凋亡改善大鼠脑损伤后的学习记忆能力。

脑损伤；头孢曲松钠；海马；凋亡；脑水肿

创伤性脑损伤(TBI)的具体病理机制目前未完全阐明。研究显示脑损伤后出现神经细胞凋亡可能参与TBI的病理生理过程〔1〕。据报道β-内酰胺类抗生素头孢曲松钠具有一定的脑保护作用〔2,3〕，但机制未明，且头孢曲松钠对大鼠脑损伤后神经细胞凋亡的影响鲜有文献报道。本研究建立液压冲击脑损伤大鼠模型，观察头孢曲松钠对脑损伤大鼠的空间学习记忆能力及海马caspase-3 和caspase-9蛋白表达变化的影响。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级雄性SD大鼠72只(体重280～320 g)，河北医科大学实验动物中心提供，在标准环境(12 h黑夜/白天，25℃)饲养7 d，大鼠可以自由获取食物和水。兔抗大鼠的caspase-3、 caspase-9多克隆抗体及小鼠抗大鼠的β-actin单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。羊抗兔(或鼠)的辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG购自美国Southern Biotech公司。SABC免疫组织化学试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)蛋白浓度测定试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.2TBI模型制备及动物分组 72只健康雄性SD大鼠随机分为：假手术组，脑损伤组，治疗组(n=24)。每组又分为12、24、48及72 h 4个时间点，每时间点6只。模型制备应用腹腔注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，采用Dixon法〔4〕制备液压冲击脑损伤模型。大鼠出现弓背、竖毛、前肢屈曲、后肢强直、肌张力增高及心率加快等表现表明液压冲击性脑损伤大鼠模型制备成功。假手术组常规麻醉开颅，但不给予液压冲击处理。治疗组大鼠在手术操作前5 d，给予腹腔注射头孢曲松钠(200 mg/kg)，并连续注射5 d。

1.3Morris水迷宫试验 水迷宫由圆柱形水池和图像采集处理系统两部分组成。水池水深25 cm，水温(25±0.5)℃，将平台固定于某一象限水面下2 cm。在定位航行试验中记录大鼠逃避潜伏期，将大鼠面向池壁分别从4个不同象限入水点放入水池中，记录大鼠在水池中找到水面下方平台所需时间。空间探索试验是在定位航行试验结束后，去除隐藏在水面下平台，然后将大鼠放入水池中，选择任选入水点，记录大鼠每分钟穿越平台所在象限的次数，检测大鼠对原平台的记忆能力。

1.4脑组织含水量测定 各组行Morris 水迷宫检测后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，快速断头后剥离脑组织，依据参考文献〔5〕采用干-湿比重法测定脑组织含水量。

1.5免疫组织化学法检测 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，用多聚甲醛进行灌流固定后剥离出脑组织，在预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗后，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h。常规冲水过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片机制作石蜡切片(5 μm)，烤片，水化后进行免疫组织化学染色，按免疫组织化学试剂盒说明书操作。兔抗大鼠的caspase-3多克隆抗体的稀释浓度为1∶50，兔抗大鼠的caspase-9多克隆抗体的稀释浓度为1∶100。

1.6Western印迹法检测caspase-3、-9蛋白 低温充分裂解脑组织，匀浆后离心留取上清液。依据文献〔6〕蛋白变性后上样(20 μg)进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，干转法转至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白(BSA)进行膜封闭2 h。分别滴加兔抗大鼠的caspase-3、caspase-9多克隆抗体，或小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜。随后滴加HRP标记IgG室温孵育2 h。条带曝光显色后应用Image J软件对条带的灰度值进行分析，β-actin作为内参。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1各组学习记忆能力比较 与假手术组相比，脑损伤组伤后各时间点间逃避潜伏期明显延长，每分钟穿越平台的次数明显减少(Plt;0.05)，治疗组各时间点大鼠与脑损伤组相比，逃避潜伏期明显缩短，每分钟穿越平台的次数也明显增多(Plt;0.05)，见表1，表2。

2.2各组脑组织含水量比较 大鼠液压冲击致伤后脑组织含水量与假手术组相比明显增加(Plt;0.05)。给予头孢曲松钠治疗后各时间点脑组织含水量显著减少(Plt;0.05)，见表3。

2.3各组脑组织caspase-3 和caspase-9蛋白免疫组织化学检测结果比较 假手术组大鼠海马组织caspase-3 和caspase-9阳性细胞较少，呈现弱阳性。脑损伤组海马组织caspase-3 和caspase-9阳性细胞数目明显增多，呈现强阳性，定位于神经细胞的胞质及胞核中。治疗组较脑损伤组caspase-3 和caspase-9 的阳性细胞数减少，免疫反应性减弱，见图1，图2。

表1 各组逃避潜伏期比较

与假手术组比较：1)Plt;0.05；与脑损伤组比较：2)Plt;0.05，下表同

表2 各组穿越平台所在象限次数比较次/min)

表3 各组大鼠脑组织含水量的比较

图1 各组24 h海马组织caspase-3免疫组织化学染色结果(DAB,×400)

图2 各组24 h海马组织caspase-9免疫组织化学染色结果(DAB,×400)

2.4Western印迹检测各组caspase-3 和caspase-9蛋白表达 假手术组各时间点caspase-3 和caspase-9蛋白表达量均较低。与假手术组相比，脑损伤后12 h caspase-3 和caspase-9蛋白表达水平开始升高(Plt;0.05)，于24 h达高峰(Plt;0.05)，随后逐渐降低。治疗组脑损伤各时间点caspase-3 和caspase-9的蛋白表达量均较脑损伤组显著下降(Plt;0.05)，见表4。

表4 各组海马组织caspase-3、-9蛋白Western印迹检测结果比较

3 讨 论

研究显示脑损伤后继发性神经细胞死亡中有10%～50%是神经细胞凋亡引起的〔7〕。与细胞凋亡密切相关的caspases分子包括上游起始caspases(caspase-2、8、9和10等)和下游效应caspases(如caspase-3、6和7等)。其中caspase-3在凋亡程序中处于核心位置，是级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行者，被称为 “死亡蛋白酶”，是细胞凋亡发生的关键酶〔8〕。而caspase-9是一种启动酶，接受并感知上游凋亡信号，并引起下游效应caspases的级联式活化〔9〕。本实验结果显示液压冲击性脑损伤后海马区神经细胞出现明显凋亡，凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9的蛋白表达量随着脑损伤病程时间的延长不断增加。吴思荣等〔10〕发现大鼠脑损伤后广泛存在神经细胞凋亡，且持续时间可达14 d，扩大了急性脑损伤的治疗时间窗，凋亡启动的时程变化与治疗时间窗的选择密切相关。同时还证实脑损伤中的凋亡除了具有明显的时序性外，还具有典型的空间分布特征，在脑组织中海马、齿状回等区域为凋亡的易损区。这种现象可能与损伤程度和受损部位脑组织的敏感性存在差异有关。

脑损伤中神经细胞变性以坏死和凋亡两种形式共存，其中凋亡迟发性出现但持续时间较长。在液压冲击的当时，机械性外力直接导致神经细胞死亡，而后续的继发性脑损伤(兴奋性氨基酸、自由基、钙离子超载及炎症反应等)营造的局部不良微环境通过细胞凋亡诱导神经元的迟发性死亡〔11〕。神经细胞凋亡是液压脑损伤后迟发性细胞死亡的主要方式，是脑创伤后神经行为学的改变、学习记忆功能障碍的病理基础，并且与预后密切相关。

β-内酰胺类抗生素头孢曲松钠可有效地透过血脑屏障进入脑和脊髓中发挥相应作用〔12〕。头孢曲松钠作为第三代头孢类抗生素，除了具有抗菌作用外还能够快速发挥神经保护作用〔13,14〕。本文结果显示，头孢曲松钠通过抑制TBT后海马神经细胞凋亡水平，显著改善大鼠的空间学习和记忆能力，进而发挥重要的神经保护作用。

1李 明,殷玉华,江基尧,等.急性脑损伤后神经细胞凋亡机制的研究进展〔J〕.实用临床医药杂志,2013;17(7):156-9.

2颜志婷,熊建忠,林小小,等.头孢曲松钠对脑缺血再灌注模型大鼠的脑保护作用〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(15):4241-2.

3刘 畅,贾玉洁,姜兴千,等.头孢曲松钠对局灶性脑缺血大鼠脑组织Fas和NF-κB表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(19):4210-2.

4孙国柱,赵宗茂,张更申.大鼠液压冲击伤脑水肿AQP4表达及其与水肿关系〔J〕.中华实验外科杂志,2009;26(11):1499-500.

5Bao HJ,Wang T,Zhang MY,etal.Poloxamer-188 attenuates TBI-induced blood-brain barrier damage leading to decreased brain edema and reduced cellular death〔J〕.Neurochem Res,2012;37(12):2856-67.

6Yan F,Gao J,Ying C,etal.Neuroprotective effects of resatorvid against traumatic brain injury in rat:involvement of neuronal autophagy and TLR4 signaling pathway〔J〕.Cellular Molec Neurobiol,2016;37(1):1-14.

7Yah IY，Yankner BA.Apoptosis in the nerve system〔J〕.Nature,2000;407(6807):802-9.

8Adamczyk A,Kazmierczak A,Czapski GA,etal.Alpha-synuclein induced cell death in mouse hippocampal (HT22) cells is mediated by nitricoxide-dependent activation of caspase-3〔J〕.FEBS Lett,2010;584(15):3504-8.

9陈廷福,金先庆,杨 坤,等.丙泊酚、神经节苷脂对幼鼠认知和caspase-3表达的影响〔J〕.解放军医学杂志,2010;35(7):845-8.

10吴思荣,惠国桢,李向东,等.大鼠创伤性脑损伤后神经细胞凋亡的动态变化及其与caspase-3基因表达的关系〔J〕.中华急诊医学杂志,2009;18(4):361-6.

11冯志仙,杨小锋,郑学胜,等.创伤性脑损伤后细胞凋亡及Bcl-2基因治疗〔J〕.中华创伤杂志,2007;23(8):561-4.

12Spector R.Ceftriaxone transport through the blood-brain barrier〔J〕.J Infect Dis,1987;156(1):209-11.

13Cui C,Cui Y,Gao J,etal.Neuroprotective effect of ceftriaxone in a rat model of traumatic brain injury〔J〕.Neurol Sci Off J Italian Neurol Soc Italian Soc Clin Neurophysiol,2014;35(5):695-700.

14Feng D,Wang W,Dong Y,etal.Ceftriaxone alleviates early brain injury after subarachnoid hemorrhage by increasing excitatory amino acid transporter 2 expression via the PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway〔J〕.Neuroscience,2014;268:21-32.

〔2016-07-19修回〕

(编辑 曹梦园)

R651.1+5

A

1005-9202(2017)22-5555-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.030

唐山市科学技术研究与发展计划资助项目(12140209A-31)

1 华北理工大学基础医学院

周洪霞(1970-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事脑损伤基础研究。

李 萍(1978-)，女，硕士，检验师，主要从事脑损伤基础研究。