冷冻电镜：四十年风雨无阻路终得云开见月明
——2017年诺贝尔化学奖简介

李承珉

中国科学院生物物理研究所，北京 100101

冷冻电镜：四十年风雨无阻路终得云开见月明
——2017年诺贝尔化学奖简介

李承珉†

中国科学院生物物理研究所，北京 100101

电子显微镜强大的分辨能力能帮助人类展示微观世界的细节，在生命科学领域有着广泛的用途。但是，由于生物样品无法承受电子束的辐照损伤，电镜技术一直很难在生物样品上获得高分辨率信息。冷冻电镜技术的诞生以及近几年的分辨率革命开启了一个利用电镜技术解析生物分子结构的新纪元，该技术的几位先驱科学家也因此获得了2017年的诺贝尔化学奖。本文简要回顾了电镜三维重构技术和冷冻技术的历史和发展现状，并对未来作出展望。

冷冻电镜；三维重构；单颗粒分析；高分辨率

2017年10月，瑞典皇家科学院将诺贝尔化学奖颁发给了Jacques Dubochet、Joachim Frank 和Richard Henderson三位科学家，以表彰他们在发展和研究冷冻电镜技术方面的贡献(图1)。这是继1986年诺贝尔物理学奖后，电镜技术再次问鼎诺奖，只不过这一次颁给了化学领域。

1 电子显微镜的诞生

图1 从左至右依次为获得2017年度诺贝尔化学奖的Jacques Dubochet、Joachim Frank以及Richard Henderson(图片摘自https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/)

人类肉眼能区分的最小距离，一般在0.1～0.2 mm。如果想要将视野拓展到微观世界去识别更细微的物质，我们就得借助于显微镜。17世纪后半叶，Antony van Leeuwenhoek(列文虎克) 用自制的光学显微镜成功观察到细菌等微生物的存在，使人类对生命世界的认知前进了一大步。1872年，德国物理学家Ernst Karl Abbe和Carl Zeiss(蔡司，蔡司公司创始人)合作计算出显微镜领域划时代的阿贝公式，指出所有光学仪器的分辨率都有一个物理理论极限，这个极限分辨率约为所用照明光波波长的一半。这意味着即使使用可见光谱中波长最短(约400 nm)的紫光，我们能得到的最好分辨率也不会超过200 nm(约700个原子的直径)。19世纪末，光学显微镜的分辨率就已经被推近到接近理论极限的200 nm，为人类打开了一个丰富多彩的微观世界。但是，这个分辨率还远不足以让人们看清原子层次的细节。事实上，阿贝公式所导出的极限分辨率的限制是如此强大，以至于该公式的提出者，那个时代最伟大的光学物理学家之一的阿贝本人，也不得不感叹“人类的创造性已基本没有希望找到方法和途径来克服这个极限了(It is poor comfort to hope that human ingenuity will find means and ways to overcome this limit)”。某种程度上，阿贝的绝望是有道理的，在其离开这个世界近100年后，阿贝公式导出的光学显微镜分辨率的理论极限，才被新兴的超高分辨荧光显微术用特殊的方式打破(参考2014年诺贝尔化学奖)。不过阿贝没有料到的是，在他逝世20年后，德布罗意的天才理论会推动一个比光学显微镜更加强大的工具——电子显微镜的诞生。这个工具将接过光学显微镜的火炬，帮助人类以前所未有的清晰度，从原子层次去窥探生命世界的神奇与奥秘。

电子显微镜，简称电镜，是依据电子光学原理，利用电子束和电磁透镜代替光束和光学透镜，从而能放大观察物质的细微结构的仪器。如果要追溯电镜诞生的历史，我们往往会从1897年英国科学家J. J. Thomson发现电子开始讲起。1923年，法国科学家德布罗意首先提出电子的波粒二象性设想并成功推导出电子波长的正确表达式；1926年，奥地利物理学家薛定谔成功推导出电子波在电磁场中的运动方程；1926—1927年，德国科学家Hans Busch报道电磁透镜对电子束的聚焦效应；1927年，美国贝尔实验室的Clinton J.Davisson和英国的G. P. Thomson (J. J. Thomson的儿子，父子俩一个发现电子粒子性，一个确认电子波动性，都获得了诺贝尔物理学奖，成为科学史上的一段佳话)分别独立证实了电子的衍射性。这里每一项激动人心的发现与突破，都获得了诺贝尔物理学奖，也使得用电子束代替光束、用电磁透镜代替玻璃透镜来制造超高分辨率显微镜的想法应运而生。最终，德国工程师Ernst Ruska和Max Knoll于1931年成功制造出历史上第一台真正意义上的电子显微镜，而Ruska本人也因此获得1986年的诺贝尔物理学奖。以我们后人的眼光来看，这是顺理成章的事。不过有意思的是，很多年后Ruska回顾当年，坦诚自己在电镜研发之初，并不知道电子具有波动性，毕竟那属于当时物理学最前沿和最不可思议的量子力学领域。当第一台电子显微镜制造成功后，Ruska才从别人处获知电子的波动性并深感郁闷，因为他以为电镜分辨率同光学显微镜那样会受到阿贝成像理论的制约，不会太高。后来得知电子波长极短，所以电镜分辨率理论上完全有分辨原子的潜力，他方才转忧为喜。

2 电子显微镜在生物学领域的早期应用

电子显微镜诞生的主要催化剂，是人们希望借助于一种具有比光学显微镜更高分辨率的仪器来观测病毒。病毒的尺寸远小于细菌，一般只有100 nm或者更小，无法被光学显微镜所看到。18世纪末人类就已经假设病毒的可能存在，直到1938年才使用电镜获得直接证据。将电镜用于生物研究并获得更高的分辨率，一直是生物学界的强烈渴求。然而，当电镜真正问世后，许多生物学家和物理学家都对其在生物研究领域的应用持保守态度，即便是有些诺奖获得者也不例外。他们的保守与怀疑并非没有道理，因为将电镜技术用于生物领域，有着巨大的困难和挑战。

来自比利时布鲁塞尔自由大学的Ladislaus Marton是用电镜观测生物样品的先驱，并在1934年第一次获得了生物样品的电镜照片后，在《Nature》上简短地点评了电镜对生物样品研究的限制：“电镜的高分辨能力并不能直接用于生物学研究，除非我们能开发出一种新的组织学技术来保护生物细胞不受电子束的破坏(This high resolving power cannot be applied in biological research, however, without developing a new histological technique to prevent the destruction of the organic cells by the intense electronic bombardment)。”[1]事实上，电子束对生物样品的破坏只是挑战之一，更大的挑战来自于为了保持电镜真空的稳定，生物样品不能含有水分。同时，生物样品本身在电镜中的衬度极低，而生物样品电镜成像时所使用的极低电子剂量(为了防止电子损伤)、极薄样品厚度(为了防止电子的多重散射)，以及电子和样品相互作用带来的漂移，等等都严重限制了生物样品在电镜下的分辨率。直到近10年前，电镜技术早已在材料等领域开花结果、异常夺目，而生物学样品的电镜分辨率依然大部分在十几埃到几十埃徘徊，甚至被一度嘲笑为“blobology”(英文讽刺，即“一堆轮廓的技术”)。但是，依然有许多人坚定地认为，电子显微镜必能在生物学研究领域大放光芒。这些人包括那些电镜的发明者们、很多伟大的生物学家及物理学家们，如Marton、电镜发明者Ernst Ruska的弟弟Helmut Ruska、电子晶体学及电镜三维重构理论的先驱Aaron Klug(1982年诺贝尔化学奖获得者)，以及2017年获奖的三位冷冻电镜领域的奠基人等许多科学家。正是他们的坚持、努力和远见，才迎来今天冷冻电镜技术在结构生物学领域一骑绝尘的辉煌时代。

为了能使生物样品不易被电子束破坏，并能增加样品的衬度，人们开始在生物样品制备上下功夫。最早对制备生物样品展开研究的正是Marton。他首次提出使用铜网支撑切薄的生物组织样品，并用重金属对生物样品染色增加衬度，同时在物镜旁边增加光阑来提高像衬度。这些方法非常有效并且一直沿用至今。后来Helmut Ruska改进了Marton的重金属原子“染色”法，并发明了生物颗粒的载体，在人类历史上首次观察到了直径在60 nm左右的噬菌体的存在[2]。到了20世纪50年代，超薄切片生物样品制备技术已经成熟，电镜也开始用来观察比较复杂的生物结构，比如染色体。那是一个激动人心的时代，基本上一幅电镜图像就是一篇重要研究论文的雏形，和后来在冷冻电镜技术获得突破后，一个重要分子复合物的高分辨三维电镜结构就有可能发表一篇重量级研究论文比较相似。

到了1959年，剑桥大学的S. Brenner和R. W.Horne在前人的基础上开发出了著名的负染法(negative staining)，用金属盐对铺在载网上的生物样品进行染色，使得在电镜中生物样品周围变暗而突出样品本身。同时，这种方法还能更好地对抗电子辐射损伤，防止样品本身在真空环境里的塌缩。正是在负染色方法的帮助下，病毒、细菌、组织等生物样品的显微成像达到了前所未有的清晰程度[3]。虽然负染法有它的局限，无法展示被包埋的样品的内部结构，分辨率也受到限制(目前通过负染法能得到的最高分辨率大约是1.5 nm)，但它依然是每一个电镜研究人员用来检查筛选样品，以及快速获得样品低分辨率结构的基本手段。

3 三维重构技术的出现与电子晶体学的发展

当负染色法开始成为电镜样品制备的主流方法后，同样来自剑桥大学MRC分子实验室的Aaron Klug教授很快意识到每一张电镜照片都是样品的三维结构在某一个角度的投影，而如果想要解出这个三维结构本身，就需要拍摄更多不同角度的二维照片。这可以通过倾转样品本身或者收集大量不同角度的样品颗粒来实现[4]。利用这种思想，Klug教授和David DeRosier在1968年合作，成功解析了噬菌体T4的尾部三维结构。之所以挑选噬菌体T4的尾部，是因为其结构具有漂亮的螺旋对称性。这篇划时代的文章发表在了当年的《Nature》上，标志着电镜三维重构方法的正式诞生[5]。针对非螺旋对称的样品，Klug教授和他的同事们(Anthony Crowther和David DeRosier)提出了一种等价线理论，用于求解二维投影在三维结构中对应的角度，这也是电镜三维重构的理论基础。这种方法对于拥有高度对称的样品，比如二十面体的病毒的三维重构非常好用，但对于没有对称性的样品，则需要额外收集一套带倾转的数据来帮助求解[6]。

然而负染色的样品难以获得更高分辨率的结构，许多研究者努力想要改变这个局面，并作出了很多重要贡献，比如来自德国马普研究所的Walter Hoppe教授。他发展了一套电子晶体衍射的方法来测量蛋白结构，敏锐地意识到电子损伤导致的样品结构的改变，促进了最小剂量电子方法(minimal dose methodology)的发展，并提出了很多后来被证明行之有效的三维重构基本思想[7]。可惜他早期的成果大多发在德文期刊上，导致他的贡献被大多数人忽视。2017年获得诺奖的Joachim Frank教授，正是Hoppe当年的学生，也正是在Hoppe教授的思想影响下，提出并完善了电镜单颗粒三维重构的算法，被公认为电镜单颗粒分析的鼻祖。

在这里不得不提及美国科学家Bob Glaeser的贡献。在20世纪70年代早期，他意识到对于没有染色的样品，必须要保持极低的电子剂量来减少非弹性散射的电子带来的损伤。这种损伤意味着电子将破坏样品的化学键，改变原有结构信息。因为这种损伤不可避免，所以人们无法测定单个分子结构。由于低剂量电子带来的信噪比极低，需要大量的颗粒平均来提高信噪比，所以他提出使用晶体样品[8]。晶体中排列着数十万个规则有序的分子，即使其中一部分结构被电子破坏，我们依然可以得到足够的结构信息。在冷冻电镜还没有诞生的年代，电子晶体学确实是一种看起来可行的方法。后来在冷冻电镜领域至关重要的人物——Richard Henderson教授，最开始选择的正是这条道路。必须要提及的是，Glaeser教授也是最早开始尝试利用冷冻来降低辐射损伤的科学家。他们把样品冷却到了大约-120 ℃，这已经是当时所能达到的极限了[9-10]。

到了1975年，剑桥MRC实验室的Richard Henderson教授和他的同事Nigel Unwin一起，开创了能在室温条件下研究没有染色的蛋白晶体的二维电子晶体学三维重构技术。他们使用葡萄糖替代水来保持晶体在真空环境中的形状，并成功解析了视紫红质蛋白的三维结构，分辨率达到了7 Å，即0.7 nm[11]。这是人们第一次观测到膜蛋白的跨膜螺旋结构，也是人类首次利用电镜技术看清生物样品的二级结构。此时冷冻电镜技术尚未诞生，没有冷冻技术的帮助，只能依靠二维晶体中大量规则排列的分子平均效应抵消辐射损伤的影响，这实在是一个让人觉得不可思议的伟大创举。15年后，在冷冻技术的帮助下，Henderson教授成功地将细菌视紫红质二维晶体结构分辨率推至了3.5 Å[12](图2)。可惜的是，这样一个划时代的工作并没有获得膜蛋白结构领域的诺贝尔奖，因为在更早一点的1984年，德国科学家米歇尔使用X射线晶体学方法成功得到了细菌光合作用中心蛋白质复合物的3 Å分辨率的结构，并获得了1988年的诺贝尔化学奖。但是这丝毫不影响这些工作的重要性，因为这是人类真正意义上第一次利用电镜技术获得的生物样品高分辨结构，证明了电镜技术在生物研究领域的潜力。Henderson教授和他的同事们跑遍了世界各个电镜平台来优化他们的数据，并系统地分析研究了限制电镜在生物样品上分辨率的主要因素。虽然在那个年代X射线晶体学的光芒正如日初升，并在接下来20多年里一直是结构生物学领域最主要的技术手段，吸引了大量的目光和资源；但是，Henderson并没有因为X射线晶体学的强大技术压力而放弃冷冻电镜技术。相反，他深刻地洞察到了冷冻电镜的潜力，并在这篇里程碑式的文章里总结道，随着未来电镜硬件性能的提升和制样方法的改进，冷冻电镜一定会成为一项“常规的、快速的、可以获得更多非常困难的样品结构的技术手段，即使不用晶体学的方法(This would then turn the technique we have been using into a routine and quick method,able to be used on many more difficult specimens,eventually including non-crystalline molecular assemblies)”[12]。他说的是Joachim Frank教授正在发展的冷冻电镜三维重构技术。此后，Henderson将全部精力和心血都投入到了冷冻电镜相关理论和方法的研究中，并以他深厚的物理学和电子显微学功底，加上非凡的洞察力，论证了冷冻电镜三维重构实现原子分辨率的可行性，并给出了一系列理论和实验上的准确预见[13]。毫不夸张地说，在冷冻电镜这个当时还只是小众的、冷门的甚至很多人都不看好的领域里，正是Henderson用他的远见卓识，逆流而上，鼓舞着大家砥砺前行，最终在一场分辨率革命的狂风暴雨后，开创了一个独属于冷冻电镜的辉煌时代。在这场革命风暴中，Henderson教授一直是重要的发起者、参与者和推动者。在他20世纪90年代诸多非凡预见性的文章里，他敏锐地提出了电子束导致的样品漂移是制约生物样品高分辨率的关键。后来直接引爆电镜分辨率革命的直接电子探测器(direct electron device，简称DED；有时候也会命名为direct detection device，简称DDD)，正是解决样品漂移问题的最佳方式之一，而他本人也直接投入到直接电子探测器的开发工作中并作出了重要贡献。另一项革命性的重要因素在于高分辨图像处理算法的改进，以MRC实验室的Sjors Scheres博士开发的Relion程序作为代表。

图2 左图为1975年Henderson等发表的细菌视紫红质的7 Å分辨率模型(来自文献[11])；右图为1990年Henderson等发表的细菌视紫红质3.5 Å分辨率模型(来自文献[12])

4 冷冻电镜技术的诞生与三维重构技术的发展

电镜技术用于生物学研究早在Ruska发明电镜后就开始，然而它真正开始进入佳境，应该要算冷冻电镜技术诞生之后。虽然前面提到Glaeser教授和他的学生Ken Taylor早在1974年就开始了冷冻方法的研究，但第一个发明真正意义上有效并实用化的样品冷冻方法的是海德堡欧洲分子生物学实验室(EMBL)的Jacques Dubochet教授和他领导的小组。Dubochet教授是位非常聪明幽默的科学家，这点可以从他在洛桑大学官网上写的简历就可以看出来。从1978年开始，作为EMBL小组的领头人，他系统研究了水在冷冻条件下的各种性状，并最终在1981年12月发表了他如何在制备电镜样品时让水成功进入玻璃态的方法，就是迅速冷冻，跳过形成冰晶的阶段，直接进入玻璃态[14]。玻璃态是水在气态、液态和固态外的另一种状态。要使水进入玻璃态，必须急速冷冻到-108 ℃。玻璃态水和冰不一样，它没有固定形状，没有晶体结构，而且水在玻璃态下密度和液态密度相同。这对于生物样品有着特殊意义，因为冰的密度比水要小10 %，水一旦结冰，生物样品就会体积膨胀而破坏结构，而如果能直接进入玻璃态，就可以避免这个问题。在尝试液氮失败后，Dubochet和他的小组使用液态乙烷或丙烷成功实现了冷冻生物样品的方法，并在1984年《Nature》杂志上展示了他们利用这种方法成功获得的病毒照片[15](图3)。通过这种方法冷冻后的样品，完整地保持了其天然状态，有效减少了电子对样品的辐射损伤(能降低4～5倍)，还能提供非常不错的衬度。该方法成功解决了自从电镜诞生后的50年内一直困扰生物学界的问题：“水是生命体组织最丰富的存在，却一直被电镜技术排除在外(The most abundant constituent of living things,water, has invariably been excluded) ”，所以一经问世，便广为流传，一直到今天都是冷冻电镜领域，包括单颗粒重构技术和断层扫描技术里最主要的样品制备手段。冷冻电镜真正的强大，正在于它可以“冷冻一切”，无论是生物组织、溶液中的大分子、病毒或者核糖体，只要有需求，冷冻电镜都可以通过冷冻的手段来帮助我们观察生物对象，并提供重要的结构信息。

图3 Dubochet和其小组开发的冷冻样品制备流程(图片摘自https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/fig_ke_en17_dubochetspreparationmethod.pdf，最下方的冷冻病毒照片来自文献[15] )

冷冻电镜技术获得生物学样品结构信息的最主要武器，在于三维重构。正如前文所提，Joachim Frank正是开发这个武器的鼻祖。出身于德国的Frank师从电子显微领域的先驱Hoppe教授，拥有非常好的数理基础和德国人特有的严谨认真。正如Hoppe教授主张的那样，Frank也相信可以不通过结晶对任意形状的样品进行直接三维重构并获得其空间结构信息。想要做到这一点，就必须要准确知道电镜照片上每个颗粒的取向参数，包括两个平移参数和三个空间角度参数。但是，这对于不染色、不结晶、没有对称性、随机角度分布的冷冻样品而言，是非常困难的。尤其是电镜图像的背景噪音非常嘈杂，想要从中准确识别可用于颗粒对齐的特征，具有很大的挑战性[16]。从20世纪70年代开始，Frank和他的同事们一起，开始尝试使用互相关函数(crosscorrelation functions)来对齐颗粒，并在1977年通过理论分析表明，在非破坏性的电子剂量下获得的随机取向的多个颗粒可以通过互相关函数来准确进行对齐[17]。同时，他还提出了可以使用类平均技术来降低噪音，帮助求取正确的取向并最终获得高分辨结构[18]。虽然限于当时的生物制样技术和电镜本身的瓶颈，所研究的负染色样品的三维重构还无法获得高分辨率结构，但这两大基本思路成为了后来冷冻电镜三维重构技术最基本的概念(图4)。非结晶生物样品的单颗粒三维重构还有另一重大困难，那就是样品本身的不均一。电镜单颗粒三维重构的一个基本假设是电镜照片上的每一个颗粒是来自于均一样品的不同取向的投影，但绝对均一的样品是不存在的，即使纯化分离得再好，样品本身也是有多种状态的。为了解决这个问题，1981年Frank和Van Heel一起提出了分类的方法，依据颗粒本身的取向和特征，借助多元统计分析，分成诸多亚类[19]。为了确定这些二维亚类和自身在三维空间中的关系，Frank和Michael Radermacher提出了著名的RCT(random conical tilt)法[20]。这些图像处理的算法都被集成到了他们开发的三维重构软件SPIDER中，供科学研究人员免费使用，并为电镜三维重构的推广起了重要作用。除了电镜三维重构技术，Frank还一直致力于使用冷冻电镜研究核糖体相关结构，并做了很多开创性的工作，为核糖体研究作出了重大贡献。在X射线晶体学还没能获得足够高的核糖体分辨率的时候，Frank教授对核糖体的电镜解析工作为核糖体的研究提供了巨大的帮助，而且后来被人广泛使用的核糖体制样方式也是Frank教授的研究组所完善的。可惜当年核糖体结构的诺贝尔奖授予的科学家没有包括他，而是授予了采用X射线晶体学获得核糖体原子分辨率的三位科学家。随着冷冻电镜的革命性突破，以前用X射线晶体学研究核糖体的实验室如今也大量采用冷冻电镜技术。Frank教授现在这个因冷冻电镜三维重构而获得的诺贝尔化学奖，可谓实至名归。

图4 Joachim Frank开发的电镜三维重构基本策略(图片摘自https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/fig_ke_en_17_dubochetspreparationmethod.pdf)

5 冷冻电镜分辨率革命

让冷冻电镜这个小众领域突然成为一个热门研究领域的，正是前面所提到的那场分辨率革命风暴：直接电子探测器的使用以及三维重构算法的突破。直接电子探测器早前在天文学领域就已率先开始使用。2005年前后，冷冻电镜技术解析的结构分辨率还较低，当时能做到的最好分辨率是利用高对称病毒颗粒求解的7.4 Å，如果是大一点的复合物，譬如核糖体，则只能做到11.5 Å左右。当时电镜照片的记录载体是胶片或CCD(charged coupled device)。胶片比实时方便的CCD拥有更好的探测效率(detective quantum efficiency，简称DQE)，但非常费时。人们迫切需要一个全新的、能高效率探测到电子(提升信噪比)同时还能方便快速实时的相机。来自加州大学圣地亚哥分校(UCSD)、伯克利国家实验室(LBNL)和加州大学欧文分校(UCI)的联合小组，以及MRC实验室Faruqi和Henderson领导的小组都将目光转向了直接电子探测器，并分别独立发表了他们的工作[21-22]。后来UCSD和UCI的小组开发了DE(direct electron)相机，MRC小组和FEI公司合作开发了Falcon相机，LBNL小组以及加州大学旧金山分校(UCSF)的David Agard教授则帮助Gatan公司开发了K2相机。2012年到2013年前后，这些直接电子探测器相机开始大范围应用到冷冻电镜领域中。相比较传统光电耦合的CCD相机，直接电子探测器可以精准地计算出电子的位置来显著地提高电镜的图像质量，而且能用类似电影的方式快速记录电镜图像，从而帮助我们追踪并矫正样品漂移轨迹，同时还可以矫正辐射损伤。这些优势都将冷冻电镜的图像质量提高到了一个全新的台阶，使冷冻电镜的分辨率因此得到了极大的提高，并达到可以和X射线相媲美的程度(图5)。而且，冷冻电镜技术不需要结晶，对样品的质量和使用量也远没有晶体学需求的那么高，并且能利用三维分类等方法一次解出多种状态的结构，引起了研究者的极大关注，因此，许多传统晶体学研究组也开始转向并大量应用冷冻电镜技术。

除了直接电子探测器外，还有很多硬件上的突破，譬如高端场发射电子显微镜、更加稳定的冷冻杆等，都促成了这一次分辨率的革命。随着相位板技术的发展和球差矫正器的应用，曾经因为衬度极低而让人们一筹莫展的小分子蛋白，利用电镜技术解析其结构也开始成为可能[23]。

在冷冻电镜硬件技术不断突破的时候，三维重构算法也愈加完善和成熟。如何在强大的噪音干扰下对齐颗粒与分类，一直是冷冻电镜三维重构最艰难的挑战。1998年，Sigworth开始将统计学领域久负盛名的最大似然估计法(maximumlikelihood estimators，简称ML算法)引入三维重构算法中，用来对齐颗粒和二维分类[24]。来自西班牙国家生物技术中心的Jose Carazo教授和他的博士后Sjors Scheres一起将ML算法推广到三维分类领域并集成到了他们的软件包Xmipp中[25]。在ML算法基础上，后来加入MRC的Sjors Scheres博士引入了贝叶斯方法，并开发了强大的Relion程序[26]。由于其交互页面简洁，不需要过多人工干预，对新手极其友好，加上强大的三维分类能力，很快便成为了冷冻电镜单颗粒三维重构领域的流行软件工具，帮助人们取得一个又一个漂亮而震撼的原子结构。

图5 冷冻电镜分辨率革命：2013年后冷冻电镜分辨率大幅提升，从此重构出的电镜生物样品从图左侧变成了右侧这样(图片摘自https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/fig_ke_en_17_blobology.pdf)

非常值得一提的是，在这一场冷冻电镜技术革命中，一大批华人科学家作出了不可磨灭的贡献。2013年底，加州大学旧金山分校(UCSF)的程亦凡教授和合作者首次利用冷冻电镜技术解析了近原子分辨率的膜蛋白结构，引起业内轰动[27]。膜蛋白是结构生物学领域最具挑战性的课题之一，一直以来人们都认为冷冻电镜很难对其有突破。然而，程亦凡教授领导的研究小组用

3.3 Å的分辨率告诉大家，冷冻电镜的革命与辉煌已经开始。除了程亦凡教授外，还有一大批华人学者在冷冻电镜领域取得了诸多突破性成果。国内这几年在冷冻电镜领域也获得了许多意义重大、影响深远的成果。

6 回顾与展望

在冷冻电镜取得辉煌成就的同时，更多的技术突破与惊喜正在前方等着我们。如今，冷冻电镜已经开始进入自己的黄金年代，而这离电镜问世，已经过去了80多年，离冷冻电镜技术诞生，也已经过去了快40年。80年的风雨与挑战，40年的坚守与发展，终于迎来云开月明。这一切，没有历代先驱科学家们的努力，没有Jacques Dubochet的冷冻制样方法，没有Joachim Frank的三维重构技术，没有Richard Henderson用事实和理论为整个领域指明方向与道路，是不可能做到的。得奖的是他们，荣誉却属于整个冷冻电镜领域。虽然前方道路依然崎岖，未来挑战依旧，但冷冻电镜的辉煌，才刚刚开始。

致谢 在本文的写作中，要特别感谢剑桥大学MRC实验室的张凯博士为本文提供的重要的史实资料和提出的宝贵意见。

(2017年11月16日收稿)

[1] MARTON L. Electron microscopy of biological objects [J]. Nature,1934, 133: 911.

[2] KRUGER D H, SCHNECK P, GELDERBLOM H R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses [J]. Lancet, 2000, 355(9216): 1713-1717.

[3] BRENNER S, HORNE R W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1959, 34: 103-110.

[4] KLUG A, FINCH J T. Structure of viruses of the papilloma-polyoma type. I. Human wart virus [J]. Journal of Molecular Biology, 1965, 11:403-423.

[5] DE ROSIER D J, KLUG A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs [J]. Nature, 1968, 217(5124):130-134.

[6] CROWTHER R A, DEROSIER D J, KLUG A. The reconstruction of a three-dimensional structure from projections and its application to electron microscopy [J]. Proceedings of the Royal Society of London Series A-Mathematical and Physical Sciences, 1970, 317(1530): 319-340.

[7] HOPPE W. Towards three-dimensional "electron microscopy" at atomic resolution [J]. Die Naturwissenschaften, 1974, 61(6): 239-249.

[8] GLAESER R M. Limitations to significant information in biological electron microscopy as a result of radiation damage [J]. Journal of Ultrastructure Research, 1971, 36(3): 466-482.

[9] TAYLOR K A, GLAESER R M. Electron diffraction of frozen,hydrated protein crystals [J]. Science, 1974, 186(4168): 1036-1037.

[10] TAYLOR K A, GLAESER R M. Electron microscopy of frozen hydrated biological specimens [J]. Journal of Ultrastructure Research,1976, 55(3): 448-456.

[11] HENDERSON R, UNWIN P N. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy [J]. Nature, 1975,257(5521): 28-32.

[12] HENDERSON R, BALDWIN J M, CESKA T A, et al. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryomicroscopy [J]. Journal of Molecular Biology, 1990, 213(4): 899-929.

[13] HENDERSON R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules [J]. Quarterly Reviews of Biophysics, 1995, 28(2): 171-193.

[14] DUBOCHET J. Cryo-EM—the first thirty years [J]. Journal of Microscopy, 2012, 245(3): 221-224.

[15] ADRIAN M, DUBOCHET J, LEPAULT J, et al. Cryo-electron microscopy of viruses [J]. Nature, 1984, 308(5954): 32-36.

[16] FRANK J. Averaging of low exposure electron micrographs of nonperiodic objects [J]. Ultramicroscopy, 1975, 1(2): 159-162.

[17] SAXTON W O, FRANK J. Motif detection in quantum noise-limited electron micrographs by cross-correlation [J]. Ultramicroscopy, 1977,2(2/3): 219-227.

[18] FRANK J, GOLDFARB W, EISENBERG D, et al. Reconstruction of glutamine synthetase using computer averaging [J]. Ultramicroscopy,1978, 3(3): 283-290.

[19] VAN HEEL M, FRANK J. Use of multivariate statistics in analysing the images of biological macromolecules [J]. Ultramicroscopy, 1981,6(2): 187-194.

[20] RADERMACHER M, WAGENKNECHT T, VERSCHOOR A, et al.Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli [J]. Journal of Microscopy, 1987, 146(2): 113-136.

[21] MILAZZO A C, LEBLANC P, DUTTWEILER F, et al. Active pixel sensor array as a detector for electron microscopy [J]. Ultramicroscopy,2005, 104(2): 152-159.

[22] FARUQI A R, HENDERSON R, PRYDDETCH M, et al. Direct single electron detection with a CMOS detector for electron microscopy [J].Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A:Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment,2005, 546(1): 170-175.

[23] KHOSHOUEI M, RADJAINIA M, BAUMEISTER W, et al. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 A determined with the Volta phase plate [J]. Nature Communications, 2017, 8: 16099.

[24] SIGWORTH F J. A maximum-likelihood approach to single-particle image refinement [J]. Journal of Structural Biology, 1998, 122(3): 328-339.

[25] SCHERES S H, GAO H, VALLE M, et al. Disentangling conformational states of macromolecules in 3D-EM through likelihood optimization [J]. Nature Methods, 2007, 4(1): 27-29.

[26] SCHERES S H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination [J]. Journal of Structural Biology,2012, 180(3): 519-530.

[27] LIAO M, CAO E, JULIUS D, et al. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy [J]. Nature, 2013,504(7478): 107-112.

科学家或发现地球最古老生命痕迹

一项新的研究表明，加拿大东北部的古代岩石中可能含有超过39.5亿年的生命化学物质。如果得到证实，这一发现将成为地球上已知最早的生命迹象，并将最古老生命的纪录往前推了1亿多年。

对一些科学家来说，这项研究增加了越来越多的证据，表明年轻的地球曾充满了许多不同种类的生物体。“接受它！”英国伦敦大学学院的地球化学家Dominic Papineau说。他在2017年3月发表了一项研究成果，报告来自魁北克的至少可以追溯到距今37.7亿年前的微生物化石。

但也有人对这项最新的工作是否经得住推敲表示怀疑。许多之前宣称的最古老生命形式一直存在激烈的争论，这部分缘于数十亿年前形成的岩石往往经历了严重的加热和挤压，使其地质背景通常难以解释，同时也缘于生命的化学痕迹在不涉及生物体的反应中很难加以区分。

“当读到这篇文章的时候我想，‘我们要重新来过’。”瑞典斯德哥尔摩自然历史博物馆地质学家Martin Whitehouse说。他在2002年发表了一篇研究报告，批评了有关格陵兰岛的一篇类似的古生物研究报告。

这项最新的研究调查了一组来自北拉布拉多的岩石，这些岩石被统称为“萨格里克组”。由日本东京大学Tsuyoshi Komiya和Yuji Sano领导的一个研究团队在2011—2013年期间访问了该地区，并在岩石的露头中收集了样本，而与此同时，武装警卫则一直在提防北极熊。

在2017年9月28日出版的《自然》杂志上，研究人员分析了岩石上的碳同位素和来自萨格里克组的石墨颗粒。在一些样品中，他们发现与C-12相比，同位素C-13的含量相对较低。C-12是一种较轻的同位素，其原子核中含有较少的中子。生物体更喜欢用C-12来制造有机化合物，因此微生物曾经生活过的物质——比如萨格里克岩石——在较轻的同位素中变得更加丰富。

研究小组认为，这些石墨颗粒源于古代生活在海中的细菌。它们能够利用溶于海水的二氧化碳，随着环境变化，这些细菌在海底慢慢成为岩石的一部分，最终残留下这些石墨颗粒。

Komiya表示，在这些古老的、高度变形的岩石中找到生命的证据“令人惊讶和兴奋”。他说，他和他的团队排除了其他可能的解释，比如碳同位素的倾斜比例，比如矿物铁元素的分解。而石墨似乎与其周围的岩石在挤压和加热时所经历的温度大致相同，这意味着石墨并非是后来被污染的。

在之前的论文中，Komiya的团队描述了“萨格里克组”的地质历史，并在一种叫做片麻岩的变质岩中使用了铀铅进行测年研究，结论是这种岩石已有39.5亿年。研究人员说，含有生命迹象的石墨至少也应该有这么古老。

科学界通常认为地球诞生于约46亿年前，此前发现的最早生命痕迹是在格陵兰岛，约有38亿年历史。新发现将地球生命的历史前推了约1.5亿年。但是也有一些科研人员表示，还需要更多证据才能让新发现更有说服力。

Whitehouse表示:“这篇论文的其他内容都是基于地质年表，而地质年表尚没有被很好地建立起来。”他说，“这是一间用纸牌造的房子。”而Komiya则说，他支持自己团队的解释。

研究格陵兰岛岩石中可能的生命化学物质的丹麦哥本哈根自然历史博物馆地质学家Minik Rosing对Komiya的研究团队表示赞扬，但也指出还有很多的工作需要完成。Rosing说：“这是一项很棒的研究，进行了大量复杂且高质量的分析工作。”他同时认为，这些岩石太复杂了，被研究的石墨“可能只有27亿年的历史，但依然能够通过所有的测试”。

[关毅 编译]

Cryo-EM in the past 40 years: A brief introduction to the Nobel Prize in Chemistry 2017

LI Chengmin
Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Electron microscopes have a high resolving power to reveal the details of the micro world and are used to investigate the ultrastructure of a wide range of biological specimens. However, they were long believed to not suitable for imaging biological specimens to achieve high resolution structures, because the powerful electron beam would destroy biological material and some other challenges, until the advent of cryo-electron microscopy. In this paper, we briefly reviewed the history and methodological development of electron microscopy and cryo-electron microscopy in biological specimens.

cryo-EM, three-dimensional reconstruction, single particle analysis, high resolution

10.3969/j.issn.0253-9608.2017.06.004

†通信作者，E-mail: xinzhiguyu@gmail.com

(编辑：沈美芳)