沙眼衣原体假定蛋白CT389原核表达质粒的构建及结构预测

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(1.南华大学医学院病原生物学研究所，湖南 衡阳 421001；2.湖南省邵阳学院附属医院检验科；3.南华大学医学院2016级卓越医师班)

·基础医学·

沙眼衣原体假定蛋白CT389原核表达质粒的构建及结构预测

唐翠连1,2，陈浩1，刘玖林3，周洲1*

(1.南华大学医学院病原生物学研究所，湖南 衡阳 421001；2.湖南省邵阳学院附属医院检验科；3.南华大学医学院2016级卓越医师班)

目的构建能表达沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)假定蛋白CT389的质粒pGEX6P-ct389及预测其结构。方法设计特异性引物，以Ct基因组为模板，PCR法扩增ct389基因，构建携带目的基因的重组质粒pGEX6P-ct389；通过PCR鉴定和双酶切鉴定初筛，测序鉴定验证结果；比较ct389和tc0668基因序列及其编码产物的相似性，采用生物信息学预测CT389蛋白的二级结构和三级结构。结果获得大小约为1 300 bp的ct389基因片段，并成功得到重组质粒pGEX6P-ct389。ct389和tc0668基因及其编码产物的相似性高达84%和92%，CT389蛋白α-螺旋、无规卷曲和β片层的含量分别为27.7%、49.26%和占23.04%。与其三级结构最接近的是鼠疫耶尔森氏菌的纤溶酶原激活物。结论Ct389与tc0668基因从DNA到编码产物具有较高的相似性，ct389可能是重要的沙眼衣原体毒力基因。

沙眼衣原体； 蛋白结构； 假定蛋白； CT389

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是泌尿生殖道感染的常见病原体之一，Ct具有独特生命周期、严格细胞内寄生的微生物，它能以原体(Elementary body，EB)和网状体(Reticulate body，RB)两种基本形态在感染机体所形成的生命周期中循环往复[1-3]。Ct能够引起尿道炎、宫颈炎、阴道炎和盆腔炎等多种泌尿生殖道相关疾病，并能够促进HIV的传播和提高宫颈癌的发病率，它也是目前最广泛的性传播疾病病原体之一。Ct感染患者的症状通常较轻，极易被忽视，难以及时进行治疗。临床调查发现Ct患者会反复感染，严重时可导致不孕不育、异位妊娠等并发症。虽然目前已经发现Ct的质粒蛋白和外膜蛋白等能够参与衣原体的致病过程[4- 5]，但更多潜在的Ct毒力物质有待发掘并验证。

Ct在研究工作中面临的问题之一是将Ct经生殖道感染小鼠后，Ct会被小鼠机体清除，很难通过构建动物感染模型而进行后续体内实验研究。因此，与Ct基因组相似性较高且可以成功构建小鼠阴道感染模型的Cm成为研究Ct致病机制和免疫保护作用的常规替代菌株[6-8]。CT389蛋白与鼠衣原体(Chlamydia muridarum，Cm)TC0668蛋白具有很高的同源性，但是具体功能尚不清楚，也从未引起关注[6-7]。在前期工作中，发现Cm tc0668基因与Cm感染小鼠后形成小鼠生殖道病变有关，其编码产物是一种与Cm致病有关的重要毒力因子[7-8]。既然tc0668基因与Cm致病有关，提示Ct的ct389可能也是Ct潜在的致病基因。本研究构建编码CT389蛋白的原核表达质粒pGEX6P-ct389，通过Blast比对验证其与已公布的Cm tc0668基因序列的相似性，并进一步预测其蛋白的二级结构和三级结构，为进一步研究CT389蛋白的功能提供实验基础。

1 材料与方法

1.1材料沙眼衣原体Ct D血清型菌株模板、大肠杆菌Top10和表达质粒pGEX6p-1由南华大学病原生物学研究所保存。质粒提取试剂盒、DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶和DNA聚合酶从大连宝生物公司购买；DNA marker、蛋白Marker、限制性内切酶BamH I和Not I自Fermentas公司购买；蛋白胨和酵母提取物从英国Oxiod公司购买；氨苄青霉素等化学试剂都为分析纯以上及购自上海生工生物公司。

1.2方法

1.2.1 ct389基因的扩增 通过NCBI查到ct389基因序列，设计上游引物：F：CGCGGATCCATGATGAAACCTCTACGTTTC(BamH 1)和下游引物：R：AAAGCGGCCGCCTAAAAGCCATAACTTAATCG(Not 1)，并由上海生工生物公司合成。用Ct基因组为模板，进行PCR扩增。PCR程序为：94 ℃ 5 min；(94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)×32个循环；最后72 ℃ 5 min。PCR完成后以琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，然后纯化ct389 DNA 片段。

1.2.2 重组质粒pGEX6P-ct389的构建及鉴定 将pGEX6P-1和ct389基因利用BamHI和Not I进行双酶切，然后回收，利用T4 DNA连接酶将它们相连，然后转化大肠杆菌Top10。将其涂布在含氨苄青霉素的平板中37 ℃倒置培养16 h。挑取单菌落接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃，200 rpm过夜培养，提取质粒为模板进行PCR鉴定及双酶切鉴定，初筛阳性克隆者扩增培养后提取质粒并送上海生工生物公司进行测序鉴定。

1.2.3 ct389 与Cm tc0668基因及其编码蛋白的序列比对分析 利用blast分析ct389基因和tc0668基因及其编码蛋白的相似性。

1.2.4 CT389蛋白二级结构和三级结构的预测 采用在线软件Sopma分析它的二级结构，预测时相似性阈值为8，预测构象为：helix，sheet，Turn和coil四种。采用在线软件Swiss-model搜索与CT389蛋白结构最为接近的蛋白质，然后利用该蛋白为模板，模拟预测CT389蛋白的三级结构。

2 结 果

2.1重组质粒pGEX6P-Ct389的构建与鉴定以Ct基因组为模板，进行PCR扩增，获得的片段大小约为1 300 bp，与ct389基因大小相符(图1)；将其连接到pGEX6P-1获得重组质粒pGEX6P-ct389，PCR验证结果如图2泳道1，在DNA Marker的指示下出现了一条大小与预计相符，清晰的目的条带；同时进行的酶切鉴定结果显示通过双酶切作用后，重组质粒可形成大小两条目的条带，小的基因条带与PCR鉴定结果一致(图2)。将阳性克隆送上海生工生物公司测序，比对测序结果，与NCBI公布的ct389基因序列一致，表明成功构建原核表达质粒pGEX6P-ct389。

图1 利用PCR扩增ct389基因M：Marker；1,2：ct389基因扩增产物

图2 利用PCR和酶切验证pGEX6P-ct389质粒M：Marker；1：利用PCR对 pGEX6P-ct389质粒进行验证；2：利用双酶切对pGEX6P-ct389质粒进行验证

2.2 CT389蛋白序列分析将测序的ct389基因序列与Pubmed上已公布的Cm tc0668基因序列(基因序列号：NC_002620)进行Blast比对，发现他们之间基因序列相似性高达84%。进一步将两基因编码的氨基酸序列进行相似性分析，发现CT389蛋白全长共409个氨基酸，与TC0068相同的氨基酸数目为389个，与TC0668不同的仅有20个氨基酸，氨基酸序列的相似性高达92%(图3)。通过分析，推测Ct CT389与Cm TC0668蛋白同源。

图3 Cm TC0668和Ct CT389蛋白氨基酸序列的相似性分析

2.3 CT389蛋白的结构预测Sopma软件预测CT389蛋白α-螺旋(Alpha helix)含量为27.7%，无规卷曲(Random coil)为49.26%及β片层(Extended strand)占23.04%，分散在整个蛋白(图4)。利用Swiss-model分析其三级结构，发现与其最为接近的是鼠疫耶尔森氏菌的纤溶酶原激活物(PDB：2x56.1.A)，以纤溶酶原激活物进行同源建模，预测得到CT389蛋白的三级结构，蛋白整体结构呈圆柱形，由7股β片层结构组成侧面，它们通过α-螺旋连接(图5)。

图4 CT389蛋白的二级结构示意图

图5 模拟得到的CT389蛋白三级结构

3 讨 论

病原菌的毒力是由散在或簇集的基因编码产物决定的。明确这些与致病相关的基因是进行衣原体致病机制研究的先决条件。研究证实，MIP蛋白、分泌性蛋白酶样活性因子(Chlamydia protease-like activity factor,CPAF)等衣原体蛋白能通过诱生炎症细胞因子或免疫逃逸等作用参与衣原体的致病机制[9-11]。但由于衣原体缺乏操控外源基因表达的遗传转化系统，以往研究都无法在宿主体内证明毒力因子的存在和缺失是造成病变差异的直接因素。在前期工作中发现，与Cm tc0668野生型菌株相比，Cm tc0668突变型菌株在小鼠生殖道的致病率明显降低，两者形成统计学上差异[7-8]。首次证实TC0668是参与Cm感染致小鼠上生殖道病变的重要毒力因子。因此，与Cm TC0668同源的Ct CT389也可能为Ct致人生殖道病变的潜在致病物质。

目前已开展了Cm TC0668致病机制的研究。作为一种新发现的可能与Ct致病相关的蛋白，迄今为止还没有关于CT389蛋白的功能和相关机制的报道。本文通过PCR方法获得了ct389基因，并将其连接到载体pGEX6P-1得到重组质粒pGEX6P-ct389，表达获得编码GST与CT389的融合蛋白。通过Blast基因序列比对，发现ct389和tc0668基因在DNA序列上可产生高达84%的相似性。进一步通过氨基酸序列的相似性分析，发现CT389和Cm TC0668蛋白在氨基酸序列的相似性高达92%，在获得蛋白一级结构相关信息的基础上，还进一步利用生物信息学软件分析了CT389蛋白的二级和三级结构，发现CT389蛋白与鼠疫耶尔森氏菌的纤溶酶原激活物蛋白可能具有相似的结构，推测CT389蛋白可能通过降解纤维蛋白，促进衣原体在组织中扩散有关。本实验为研究CT389蛋白的功能提供了实验证据，为进一步寻找防治Ct的对策提供研究基础。

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ConstructtheprokaryoticexpressionplasmidencodehypotheticalproteinCT389fromChlamydiatrachomatisandstructureprediction

TANG Cuilian,CHEN Hao,LIU Jiuling,et al

(InstitutionofPathogenicBiology,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo construct the prokaryotic expression plasmid pGEX6P-ct389 which express Chlamydia trachomatis hypothetical protein CT389 and predict its protein structure.MethodThe specific primers were designed and the Ct 389 gene was amplified through PCR by using Ct genome as template to construct prokaryotic expression plasmid pGEX6P-ct389 which contain the ct389 gene.The similarity between ct389 and tc0668 gene and their proteins were compared.The binary and ternary structure were analyzed by bioinformatics.ResultsThe 1300 bp length of Ct389 gene was gained and the recombinant plasmid pGEX6P-Ct389 was constructed successfully.The similarities of ct389 and tc0668 genes and their coding products were up to 84% and 92% respectively.The content of alpha-helix,random coil and beta sheet of CT389 protein are 27.7%,49.26% and 23.04%.The ternary structure of CT389 protein is similar to the structure of Pla protein from Yersinia pestis．ConclusionFrom DNA to coding product,ct389 has high similarities with tc0668 gene,and ct389 gene may be an important Chlamydia trachomatis virulence factor.

Chlamydia trachomatis; Protein structure; Hypothetical protein; CT389

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.002

2017-04-25；

2017-06-18

国家自然科学基金项目(No.31570179，30901352)；湖南省自然科学基金(No.13JJ4072)；湖南省教育厅优秀青年基金(No.12B109)；湖南省分子靶标新药研究协同创新中心资助项目(No.2015-351)；特殊病原体防控湖南省重点实验室资助项目(No.2014-5号)；湖南省重点学科资助项目(No.2011-76).

*通讯作者，E-mail:Susiezhou99503@163.com.

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