杞黄颗粒对大鼠脉络膜新生血管模型组织中ICAM-1蛋白及mRNA表达水平的探讨

关玉双 梁凤鸣 王莉 王燕 黎红梅 王莹莹 全颖

·实验研究·

杞黄颗粒对大鼠脉络膜新生血管模型组织中ICAM-1蛋白及mRNA表达水平的探讨

关玉双1梁凤鸣1王莉1王燕2黎红梅1王莹莹1全颖1

目的探讨杞黄颗粒对激光诱导脉络膜新生血管模型大鼠视网膜色素上皮层(RPE)一脉络膜一巩膜复合体ICAM-1蛋白含量及其mRNA表达水平的影响。方法选取BN大鼠81只,随机选取13只为空白对照组,余68只大鼠右眼利用倍率532nm激光(功率300nw、曝光时间0.05s、光斑大小50um)光凝,建立CNV模型。光凝7天后,随机选取3只大鼠,行FFA和OCT检查,经心脏灌注处死,分别做RPE-脉络膜-巩膜复合体铺片检测CNV的面积,验证大鼠脉络膜新生血管模型形成。余下65只造模大鼠随机分为五组,即杞黄颗粒A组、杞黄颗粒B组、雷珠单抗组、杞黄颗粒+雷珠单抗组,模型组。造模成功后开始给药,用药60天后总结,杞黄颗粒B组用药90天总结。实验结束采用心脏灌注处死,摘除右眼球,提取RPE-脉络膜-巩膜复合体,应用Western blot技术分析ICAM-1蛋白含量,用Real-time PCR获取ICAM-1 mRNA表达水平。结果激光诱导大鼠CNV模型组织形成过程中ICAM-1蛋白的表达,5组ICAM-1/tublin差异有统计学意义(F=22.798,P<0.01);空白对照组ICAM-1/tublin均低于其他各组(P<0.01);模型组,杞黄颗粒组ICAM-1/tublin均高于杞黄颗粒+雷珠单抗组,差异有统计学意义(P<0.01);杞黄颗粒+雷珠单抗组、空白对照组、雷珠单抗组差异均无统计学意义(P>0.05);杞黄颗粒组和雷珠单抗组ICAM-1/tublin相比,差异无统计学意义(P>0.05);60d杞黄颗粒组和90d杞黄颗粒组ICAM-1/tublin相比,差异无统计学意义(P>0.05)。空白对照组ICAM-1mRNA表达均低于其他各组(P<0.01);模型组,杞黄颗粒组和雷珠单抗组ICAM-1mRNA表达均高于杞黄颗粒+雷珠单抗组,差异有统计学意义(P<0.05);杞黄颗粒组和雷珠单抗组ICAM-1基因表达相比,差异有统计学意义(P<0.01);90d杞黄颗粒组ICAM-1表达低于60d杞黄颗粒组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论ICAM-1在CNV中存在高表达。雷珠单抗对ICAM-1的高表达有抑制作用,杞黄颗粒+雷珠单抗长时间联合使用的效果更好。

杞黄颗粒; 脉络膜新生血管; ICAM-1

脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization,CNV)对视网膜破坏严重,常致视力不可逆下降或丧失,为多种眼底疾病的最终结局,主要发生CNV的眼底病如年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration,AMD)现已经成为西方国家的首要致盲病因,我国发病率也逐年升高[1-2]。CNV的形成机制尚未完全阐明,已有研究发现主要有多种细胞因子、细胞外基质参与CNV的形成过程,这些新生血管生长因子包括血管内皮生长因子(vascular en- dothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子、色素上皮衍生因子、胰岛素样生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和其他一些炎性细胞因子等[3-5]。近年发现VEGF受到上下游通路缺氧诱导因子(HIF-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)等多因素调控。本实验通过建立CNV模型,观察杞黄颗粒对RPE一脉络膜一巩膜复合体ICAM-1蛋白含量和基因表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1动物

健康雄性BN大鼠81只,体重200～250g,北京维通利华实验动物有限公司提供,实验前双眼前节和眼底检查均正常。每只大鼠随机取右眼为实验眼,左眼为对照眼。

1.1.2仪器设备

532nm 倍频Ng YAG激光器(法国Quantel Medical公司);荧光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)和吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)摄像机(德国Heidelberg公司);光学相干断层扫描仪(OCT,德国Heidelberg公司),LV 100激光共焦显微镜(日本 Olympus公司);蔡司200眼科手术显微镜等。

1.1.3试剂

复方托吡卡胺滴眼液(卓比安,沈阳兴齐眼药股份有限公司),1%戊巴比妥钠(上海泰瑞尔生物技术有限公司),若丹明标记的蓖麻子凝集素(美国Vector公司),10%荧光素钠注射液(广州白云山明兴制药有限公司),吲哚菁绿注射液(河南新华化工贸易公司),雷珠单抗注射液(Lucentis,Genentech公司),HFI-1一抗、VEGF一抗、ICAM-1一抗(Proteintech公司)等。

1.2 方法

1.2.1CNV动物模型的建立及验证

选体重200～250g健康雄性BN大鼠81只,随机选取13只为空白对照组,其余68只大鼠均利用倍率532nm激光(功率300nw、曝光时间0.05s、光斑大小50um)光凝方法,经1%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉,复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后,通过裂隙灯和载玻片将倍频532nm激光导入大鼠眼内。避开大血管,每眼距视盘1.5～2.0PD围绕视盘在视网膜血管之间光凝10个点,激光功率300mw,光凝斑直径50um,光凝时间0.05S。以光凝后有气泡产生为度,表示已击破Bruch膜。造模后第7天,68只大鼠中随机选取3只大鼠,均行OCT、FFA验证CNV形成。

1.2.2FFA和OCT检测

分别于光凝后每组随机抽取3只大鼠,散瞳及麻醉后,麻醉方法同前,腹腔内注射10%荧光素钠注射液1ml/kg,立即通过德国海德堡眼底血管造影仪连续观察,观察时间为30min,观察时间点分别为2min,5min,15min,30min。OCT检查采用视网膜颞侧后极部和视盘中心连线的直线横向线性扫描,长度2.8mm,深度2mm,每只眼睛重复5次,以观察CNV渗漏情况。

1.2.3病理铺片制作及观察

3只模型大鼠过量麻醉大鼠,经心脏灌注400mL生理盐水和400mL4%多聚甲醛,摘除右眼球,在4%多聚甲醛中后同定30min,然后置PBS中2h。显微镜下去除角膜、晶状体和视网膜神经感觉层。在剩余的RPE一脉络膜一巩膜复合体做6～8个放射状切口,使之展平。将铺片置于1%Triton X-100中室温放置24h。接着与若丹明标记的蓖麻子凝集素(1:1000)在室温下避光孵育24h。最后于TBS缓冲液中避光洗涤24h。将铺片在载玻片上展平,水性封片剂封片后激光共焦显微镜下观察并拍照。

1.2.4动物分组及给药

除验证CNV模型成立3只大鼠外,剩余65只模型BN大鼠随机分为5组,即杞黄颗粒A组、杞黄颗粒B组、雷珠单抗组、杞黄颗粒+雷珠单抗组、模型组。每组均13只。造模后7天开始给药,用药2个月后总结。杞黄颗粒B组用药90天后总结。空白对照组、模型组用生理盐水灌胃,每日1次,每日用量不超过2ml,灌胃周期60天;杞黄颗粒组和杞黄颗粒+雷珠单抗组均行杞黄颗粒灌胃,每日1次,每次每只鼠杞黄颗粒药量为1g,溶解于水中,灌胃量以1ml/100g体重,以每只鼠灌胃量不超过2ml为标准;雷珠单抗组、杞黄颗粒+雷珠单抗组在造模后行玻璃体内注射雷珠单抗注射液,每月1次,注药量3UL/眼,周期为60天,共计注药3次。

1.2.5免疫组织化学检测

具体步骤如下:(1)配制分离胶为10%的SDS-PAGE凝胶(下层分离胶,单面),混匀后,迅速灌胶至玻璃板总高度的约2/3位置,而后在凝胶上方加入水饱和正丁醇1 mL以保证凝胶上层的平整,静置待胶凝固。(2)配制SDS变性5%聚丙烯酰胺凝胶(上层积层胶,单面),混匀后,迅速灌胶至填满玻璃板,插入梳子,静置待胶凝固。电泳前拔去梳子,将凝胶置于1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液中,并用注射器针头吹净上样孔。(3)将蛋白样品与5×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)混合后,煮沸变性5 min,冰浴5 min。取合适量的蛋白样品上样,进行SDS变性10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),直至目的蛋白有效分离后停止电泳。(4)电转膜:电泳分离后的蛋白电转至硝酸纤维素膜上(Millipore,USA),100mA,90min。(5)封闭:将硝酸纤维素膜做标记以区分正反面及左右侧,浸入Blotto 封闭液中,室温摇床上轻轻摇动2小时。(6)与一抗的结合:将膜置于含对应一抗的Blotto中在摇床上4℃轻轻摇动过夜。(7)在1×TBST中摇动浸洗3次×5分钟,洗去非特异结合的一抗。(8)与二抗的结合:将膜浸入含相应HRP-羊抗兔IgG的Blotto中,室温轻轻摇动2h。(9)在1×TBST中摇动浸洗3次×5分钟,洗去非特异结合的二抗。(10)最后用Western Lightning○R-ECL,Enhanced Chemiluminescence Substrate(Perkin Elmer,NEL100001EA)检测,显影。(11)立即将膜置于曝光盒中,并在暗室中对感光胶片进行曝光1 min,而后进行显影、定影处理。(12)胶片用LabWorksTM凝胶成像及分析系统进行摄像,分析各条带的亮度值并绘制柱状图。

1.2.6RT-PCR分析ICAM-1的mRNA表达水平

杞黄颗粒B组造模90天,余各组干预60天,处死方法同前,以同样方法获取RPE-脉络膜-巩膜复合体。用紫外分光光度法测定RNA纯度及浓度,mRNA的A260/A280的值均在1.8～2.0范围内。取1μg样品,进行1%琼脂糖电泳。80V,10～15分钟。取2ug RNA运用Promega MMLV返转录酶(Cat No: 9PIM170)及相关试剂进行返转录反应,将总RNA反转录成相应的DNA。

运用Primer Premier 5.0软件,设计引物扩增ICAM-1、β-actin的部分CDS区。ICAM-1-S:5'-CTGCCTCAGGGATCCGTAAAG-3',ICAM-1-AS:5'-CCTCTGCCTCAGGAATGACAT-3',产物长度应为299bp。β-actin-S:5'-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3',β-actin -AS:5'-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3',产物长度应为78bp。

1.3 统计学方法

所得数据采用计量资料数据用均数±标准差表示,组间均值差异性采用软件进行t检验分析。计量资料进行F检验,用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 FFA和OCT的观察

腹腔注入荧光素钠约2min后开始显影,正常BN大鼠视网膜血管充盈呈放射状,光凝后2周,FFA显示光凝斑中CNV阳性部分为动脉早期呈现血管性强荧光,且造影后期荧光素持续增强扩散的高荧光区。OCT可见团块或不规则高反射灶。见图1,图2。

图1 FFA检查示光斑处CNV渗漏情况

图2 OCT检查眼底所见

2.2 检测ICAM-1的蛋白表达:见表1,表2,图3,图4

2.2.160天各组ICAM-1的蛋白表达采用单因素方差分析,5组ICAM-1/tublin差异有统计学意义(F=22.798,P<0.01)。模型组,杞黄组,雷珠单抗组ICAM-1/tublin均高于空白对照组(P<0.01),模型组,杞黄组ICAM-1/tublin均高于杞黄颗粒+雷珠单抗组,差异有统计学意义(P<0.01),杞黄颗粒+雷珠单抗组跟空白对照组和雷珠单抗组差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2.260天与90天杞黄颗粒组ICAM-1的蛋白表达采用两独立样本t检验,60d杞黄和90d杞黄ICAM-1/tublin相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 60天各组RPE-脉络膜-巩膜复合体ICAM-1蛋白含量比较

注：与空白对照组比较,☆P<0.01;与杞黄颗粒+雷珠单抗组比较,△P<0.01

表2 60天与90天杞黄颗粒组ICAM-1蛋白含量比较

2.2.360天各组两两比较ICAM-1的蛋白表达

空白对照组与模型组差异有统计学意义(P=0.000<0.01);空白对照组与杞黄颗粒组差异有统计学意义(P=0.000<0.01);空白对照组与雷珠单抗组差异有统计学意义(P=0.002<0.01);空白对照组与杞黄颗粒+雷珠单抗组差异无统计学意义(P=0.148>0.05);杞黄+雷抗组与模型组差异有统计学意义(P=0.000<0.01);杞黄+雷抗组与杞黄颗粒组差异无统计学意义(P=0.06>0.05);杞黄+雷抗组与雷抗组差异无统计学意义(P=0.070>0.05);杞黄颗粒组和雷珠单抗组差异无统计学意义(P=0.307>0.05)。

2.3 检测ICAM-1的mRNA表达水平：见表3,表4,图5,图6。

2.3.160天各组RPE-脉络膜-巩膜复合体mRNA表达采用单因素方差分析,5组ICAM-1表达差异有统计学意义(F=55.396,P<0.01)。模型组,杞黄颗粒组,雷珠单抗组和杞黄颗粒+雷珠单抗组ICAM-1表达均高于空白对照组(P<0.01),模型组,杞黄颗粒组和雷珠单抗组ICAM-1表达均高于杞黄颗粒+雷珠单抗组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

图3 60天各组RPE-脉络膜-巩膜复合体中ICAM-1的蛋白表达

图4 60天与90天杞黄颗粒组RPE-脉络膜-巩膜复合体中ICAM-1蛋白的表达

表3 60天各组RPE-脉络膜-巩膜复合体mRNA表达比较

注：与空白对照组比较,☆P<0.01;与杞黄颗粒+雷珠单抗组比较,△P<0.01

2.3.260天与90天杞黄颗粒组RPE-脉络膜-巩膜复合体mRNA表达采用两独立样本t检验,90d杞黄ICAM-1表达低于60d杞黄,差异有统计学意义(P<0.01)。

表4 60天与90天杞黄颗粒组mRNA表达比较

2.3.360天各组两两比较RPE-脉络膜-巩膜复合体mRNA表达

空白对照组与模型组差异有统计学意义(P=0.000<0.01);空白对照组与杞黄颗粒组差异有统计学意义(P=0.000<0.01);空白对照组与雷珠单抗组差异有统计学意义(P=0.000<0.01);空白对照组与杞黄颗粒+雷珠单抗组差异有统计学意义(P=0.010<0.05);杞黄+雷抗组与模型组差异有统计学意义(P=0.000<0.01);杞黄+雷抗组与杞黄颗粒组差异有统计学意义(P=0.000<0.01);杞黄+雷抗组与雷抗组差异有统计学意义(P=0.013<0.05);杞黄颗粒组和雷珠单抗组相比,差异有统计学意义(P=0.000<0.01)。

图5 60天各组ICAM-1的表达

3 讨论

目前发现VEGF下游调控因子有ICAM-1和骨髓来源细胞(BMCs),其中ICAM-1为主要的下游调控因子。ICAM-1是一种具有广泛生物学活性的免疫调节因子[6]。在VEGF调控下,ICAM-1介导中性粒细胞的粘附,释放各种酶和自由基,增加血管通透性并损伤内皮细胞,最终导致CNV形成。VEGF是一种促炎细胞因子,在增加血管渗透性及新生血管形成过程中发挥重要作用。玻璃体腔注射VEGF可以诱导大鼠视网膜组织白细胞聚集,内皮细胞黏附增强,血管通透性增加,毛细血管无灌注,同时引起视网膜组织中ICAM-1水平升高,VEGF一方面可能通过增加视网膜ICAM-1的表达,使白细胞黏附于视网膜血管,从而引起血管破坏;另一方面可能通过加强主动运输诱血管渗透性增加[7]。

中医认为,CNV形成主要与肝火旺,肾精亏,以致气虚无以摄血,阴亏血热妄行所致[8]。然而CNV属于“血证”“久病入络”、“败络丛生”,为恶证,预后不良。杞黄颗粒方药主要成分是枸杞子,楮实子,茺蔚子,丹参等。梁凤鸣教授认为方中枸杞子补肝益肾兼以明目,楮实子,茺蔚子以清肝明目,丹参等药等活血化瘀理念贯穿始终,从而达到标本兼治的目的[9]。应用杞黄颗粒能使眼脉通畅,败络消退,则脉络膜新生血管有望得到良好防治。

本实验中90d杞黄颗粒组ICAM-1表达低于60d杞黄颗粒组,差异有统计学意义(t=7.928,P<0.01),提示使用杞黄颗粒90天对于改善CNV有一定的作用。杞黄颗粒组,雷珠单抗组和杞黄颗粒+雷珠单抗组ICAM-1表达均高于空白对照组(P<0.01),杞黄颗粒组和雷珠单抗组ICAM-1表达均高于杞黄颗粒+雷珠单抗组,差异有统计学意义(P<0.05)。提示雷珠单抗对ICAM-1的表达有抑制作用,杞黄颗粒联合雷珠单抗长时间使用的效果更强。杞黄颗粒通过改善组织缺氧状态,通过下调下游通路ICAM-1表达,使中性粒细胞的粘附作用减弱,血管内皮细胞损伤减轻,血管通透性下降,CNV形成减少。中医药治疗AMD具有悠久的历史和独特优势,虽然目前中医药治疗仍然难以清除脉络膜新生血管,但在血管新生关键因子的调节方面能够起到积极作用,尤其在防止黄斑反复出血和提高视觉质量方面有效,因此通过研究开发中药来寻找治疗AMD的有效药物不失为一种好的方向和思路[10-12]。

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StudyontheexpressionlevelsofICAM-1proteinandmRNAofratmodelofchoroidalneovascularizationtissuesaffectedbyQiHuanggranule

GUANYu-shuang,LIANGFeng-ming,WANGLi,WANGYan,LIHong-mei,WANGYing-ying,QUANYing

(1.FirstTeachingHospitalofTianjinUniversityofTCM,Tianjin,China,300000;2.GuangdongProvinceTraditionalChineseMedicalHospital,Guangdong,China,510000)

ObjectiveAims:To study the effect on ICAM-1 protein and mRNA of Retinal pigment epithelium(RPE)-choroid-sclera complex of Laser-induced Choroidal neovascularization rat model affected by Qi Huang granule.MethodsWe selected 81 BN rats in which 13 rats were selected to be blank control group randomly and other 68 rats whose right eyes were photocoagulated by laser of 532nm magnification(300nw power,0.05s exposure time,the beam size of 50um)to establish CNV model.After 7 days photocoagulation,3 rats were selected to be examined by FFA and OCT and undergo cardiac perfusion to death and then RPE-choroid- sclera complex surface preparation were made respectively detecting the CNV area to verify that the formation of Choroidal neovascularization model in rats.The other 65 rats were randomly divided into five groups,which were Qi Huang granule A group,Qi Huang granule B group,Lei Zhu monoclonal antibody group,Qi Huang granule plus Lei Zhu monoclonal antibody group and model group.Drugs were given after successful model and summed up after 60 days,while Qi Huang granule B group was summed up after 90 days.At the end of the experiment cardiac perfusion of death was used,right eyeballs were removed and RPE-choroid- sclera complex was retracted,and,we used Western Blot to analyze ICAM-1 protein levels and Real-time PCR to attain ICAM-1 mRNA expression level.Resultslaser induced the expression of ICAM-1 protein of CNV model of rats during the process of tissue formation.The difference of ICAM-1/tublin in five groups was statistically significant(F=22.798,P<0.01).ICAM-1/tublin in the blank control group was lower than that in all of the other groups(P<0.01).ICAM-1/tublin in the model Group and Qi Huang granule group were both higher than that in the Qi Huang granule+ Ranibizumab group and the difference was statistically significant(P<0.01).There was no significant difference among Qi Huang granule+ Ranibizumab group,blank control group and Ranibizumab group(P>0.05).The difference of ICAM-1/tublin between Qi Huang granule group and Ranibizumab group was not statistically significant(P>0.05).The difference of ICAM-1/tublin between 60d and 90d Qi Huang granule group was not statistically significant(P>0.05).The expression of ICAM-1mRNA in blank control group was lower than that in all of the other groups(P<0.01).The expression of ICAM-1mRNA in model Group,Qi Huang granule group and Ranibizumab group were higher than that in Qi Huang granule+ Ranibizumab group and the difference was statistically significant(P<0.05).The difference of the expression of gene between Qi Huang granule and Ranibizumab group was statistically significant(P<0.01).The expression of ICAM-1 in 90d Qi Huang granule group was lower than that in 60d Qi Huang granule group and the difference was statistically significant(P<0.01).ConclusionThere is high expression of ICAM-1 existing in CNV.Ranibizumab could suppress the high expression of ICAM-1.Qi Huang granule+ Ranibizumab long used in conjunction is more effective.

Qihuang granule; Choroidal neovascularization; ICAM-1

国家自然基金面上项目:基于VEGF上下游调控通路探讨杞黄颗粒对脉络膜新生血管形成的干预机制(项目批准号:81373694)

1.300000,中国天津,天津中医药大学第一附属医院;2.510000,中国广东,广东省中医院

梁凤鸣,E-mail:liangfm66@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.001

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