补肾活血中药对大鼠慢性高眼压模型视网膜PI3K/AKt通路Bcl-2及Bad的影响

张静 李翔 汪伟 刘红佶 李祥玉 李华宏 王泰 田梦瑶 杨凤娇

补肾活血中药对大鼠慢性高眼压模型视网膜PI3K/AKt通路Bcl-2及Bad的影响

张静1,2李翔1汪伟3刘红佶4李祥玉4李华宏4王泰4田梦瑶4杨凤娇4

目的观察补肾活血中药对大鼠慢性高眼压模型视网膜Bcl-2及Bad的干预作用,探讨其作用机理。方法选取30只SD大鼠,随机分为对照组、给药组及模型组,每组各10只。采用烙闭巩膜上静脉方法制作慢性高眼压大鼠动物模型,每组连续灌胃8周后处死大鼠,观察补肾活血法对EIOP大鼠眼压、视网膜神经节细胞超微结构和视网膜Bcl-2、Bad 表达的影响。结果SD大鼠造模后即刻直至造模后8周与造模前眼压相比均升高,有统计学差异(均P<0.01),造模后8周眼压与造模后即刻相比,给药组有降低趋势,差异有统计学意义(P<0.01),模型组差异无统计学意义(P>0.05)；造模后8周,给药组Bcl-2阳性表达最高,与对照组和模型组相比,差异有统计学意义(均P<0.01),模型组Bcl-2表达多于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),模型组Bad阳性表达最高,与给药组和对照组相比,差异有统计学意义(均P<0.01),给药组的Bad的表达多于对照组,差异具有统计学意义(均P<0.01)。给药组RGCs超微结构较模型组明显改善。结论补肾活血中药(杞菊地黄丸合复方丹参片)能保护SD大鼠慢性EIOP模型视功能,主要表现为:上调Bcl-2的表达、下调Bad的表达、降低眼压及改善RGCs超微结构。

青光眼； 补肾活血中药； 视网膜； 大鼠慢性高眼压模型； 视神经保护； Bad； Bcl-2

青光眼(glaucoma)为继白内障后的世界第二大不可逆的致盲性眼病。其以病理性的眼压升高,进行性的视神经(optic nerve,ON)损害和特征性视野缺损为特点[1]。青光眼的发病机制较复杂,诸多危险因素都可以导致青光眼的产生,而最危险的因素就是病理性眼压(intraocular pressure,IOP)升高[2],所以青光眼的主要治疗措施就是将眼压控制到靶眼压。但随着对青光眼认识的不断深入,发现部分青光眼患者即使将眼压控制在正常范围内(10～21mmHg),也会发生进行性视野缺损和视力丧失,因此,青光眼视神经损伤的发病机制和视神经保护成为近年来研究的热点。

本实验采用烙闭上巩膜静脉法诱导产生高眼压维持稳定、持续时间较长的慢性高眼压动物模型[3],通过观察补肾活血中药(杞菊地黄丸和复方丹参片合用)对EIOP大鼠眼压及B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-xl/bcl-2相关死亡启动子(Bcl-associated death protein,Bad)的表达的影响,探讨其保护视功能的作用机理,为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

标准1级SD大鼠30只,雌雄不拘,8～12周龄,体重约150～200g,等价饲料饲养,大鼠及饲料均由成都中医药大学实验动物中心提供。饲养室温20～25℃,空气流通,相对湿度55%～75%,12小时光照维持,昼夜循环。自由摄食饮水。纳入标准:①无外眼疾病；②双眼瞳孔直接对光反射和间接对光反射正常；③无歪颈。

1.2 药品与试剂

复方丹参片(批号7122426)、杞菊地黄丸(批号7072153)均购于北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂。Bcl-2抗体(批号BA0412),Bad抗体(批号BA0530)均购于武汉博士德公司。

1.3 造模方法

SD大鼠购回后,适应性喂养3天,进行眼压测量,正常眼压区间估计,取平均眼压在9～18mmHg者,随机分为对照组、模型组、给药组,模型组和给药组进行单眼(右眼)造模,左眼不做处理。方法如下:大鼠称重及固定后,用3%戊巴比妥钠按1.5ml/kg体重行左下腹腔注射全身麻醉,同时术眼予0.5%盐酸丙美卡因滴眼液角结膜表面麻醉,于10点至2点钟位距角巩膜缘1～2mm剪开上方球结膜,分离筋膜,暴露角巩膜缘后3～4mm近赤道部10点、12点和1点处3支上巩膜静脉并烙闭,整复球结膜,术眼涂金霉素眼膏,待大鼠苏醒后放回笼内,0.25%氯霉素眼液滴眼,2次/日,连续6天。对照组右眼眼科手术止血器不开开关而不起烙闭作用,其余操作相同。因为灌胃等原因动物死亡4只。

1.4 分组与给药方法

对照组、模型组大鼠给予每天3ml生理盐水灌胃。将复方丹参片合杞菊地黄丸磨成粉状,加入生理盐水,每60片(18g)配置成100ml悬混液,浓度为0.18g/ml,给药组混悬液灌胃1.8g/kg.d。实验中,根据大鼠体重选取混悬液剂量。每只大鼠每天灌胃总量均3ml,所需混悬液剂量不足3ml的用生理盐水补足。每天下午17:00灌胃1次,连续灌胃8周。每2周称体重1次,依据体重调给药量。

1.5 眼压检测

每日固定时间13:00～16:00测量眼压,采用TONO-PEN笔试眼压计,分别测量3组大鼠造模前、造模后即刻、造模后二周、造模后四周、造模后六周、造模后八周右眼的IOP。

1.6 免疫组化检测

以颈椎脱臼法于造模8周后处死大鼠,立即取出眼球后,暴露视神经并保留足够长的视神经,勿牵拉及损伤视神经,自球后1mm剪断视神经,立即将其放入FAA液中固定48小时,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚4um,干燥后备用。免疫组织化学染色,详细操作步骤如下:取已切好的石蜡切片,常规脱蜡至水。3%双氧水室温孵育10 min。蒸馏水冲洗,PBS浸泡 5min。甩去多余液体,切片上滴加10%山羊血清封闭液,室温孵育10min,倾去血清,不洗,滴加稀释的Bcl-2抗体、Bad抗体(均为1:100),放入冰箱内4℃下孵育过夜。次日取出,PBS冲洗3次,每次5min。滴加生物素标记二抗工作液,湿盒内37℃水浴箱孵育30min,PBS冲洗3次,每次5min。滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP),湿盒内37℃水浴箱孵育20min,PBS冲洗3次,每次5min。配置DAB显色液,在显微镜下掌握显色程度。苏木素复染,自来水冲洗4min,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。显微镜下观察染色结果及拍片。 阴性对照:用PBS替代一抗,其余步骤同上。结果判定:随机选取高倍镜(×200)下6个视野进行观察,Bcl-2、Bad阳性表达为棕黄色染色,共36个视野,用Mias-2000型图形图像分析仪测量,求取每张切片6个视野的染色面积总和、积分光密度总和、平均黑度。

1.7 电镜下RGCs超微结构观察

各组随机选定1只大鼠,处死后立即剥离眼球,3%戊二醛浸泡预固定,1%四氧化锇再固定,丙酮逐级脱水,环氧树脂Epon812包埋,半薄切片光学定位,超薄切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色,日立H-600IV型透射电镜下观察RGCs细胞形态、核、胞膜及细胞器等,在四川大学华西医学院病理电镜室完成。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 慢性EIOP大鼠IOP

各组大鼠组间及造模、用药前后眼压比较(见表1):

由表1可见:造模前对照组、给药组及模型组IOP无明显差异(为P>0.05)；造模后即刻,对照组上升不明显,前后比较无统计学差异(P>0.05),给药组、模型组上升明显,差异有统计学意义(P<0.01),且与对照组差异明显,具有统计学意义(P<0.01)；造模后八周,给药组及模型组与造模前相比,差异有统计学意义(P<0.01)；给药组造模后八周与造模后即刻相比,差异有统计学意义(P<0.01),模型组造模后八周与造模后即刻相比,无明显差异(P>0.05)。

表1 各组造模前、造模后即刻及造模后8周眼压比较(单位:mmHg)

注：与造模前相比,△P<0.01；与对照组相比,▲P<0.01；与造模后即刻相比,☆P<0.01

2.2 补肾活血中药对EIOP大鼠视网膜Bcl-2表达的影响(见表2、图1-3)

由表2可见:检测指标为总面积、积分光密度及平均黑度,如上表所示各项指标中以给药组Bcl-2表达最多,给药组的总面积、积分光密度与对照组与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)；模型组总面积、积分光密度多于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)；给药组平均黑度与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 Bcl-2在视网膜的表达

注：与对照组相比,▲P<0.01；与给药组相比,★P<0.01

2.3 补肾活血中药对EIOP大鼠视神经Bad表达的影响(见表3,图4-6)

由表3可见:检测指标为总面积、积分光密度及平均黑度,如上表所示各项指标中以模型组Bad表达最多,其总面积,积分光密度与对照组及给药组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)；给药组的总面积、积分光密度多于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)；给药组平均黑度与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 杞菊地黄丸和复方丹参片对慢性EIOP大鼠RGCs超微结构的影响(图7-9)

正常大鼠RGCs细胞核(N)呈圆形或卵圆形,核膜清晰,染色质均匀,细胞器丰富、线粒体(Mi)内质网(ER)形态正常(图7)。造模后RGCs损伤明显,表现为细胞核(N)呈圆形或卵圆形,轮廓极不规则,核膜清晰可见,核内染色质固缩,胞浆空泡化,核糖体明显减少,残存线粒体(Mi)高度膨胀、破裂,部分内质网(ER)扩张,呈空泡状(图8)。而给予补精益视片后大鼠RGCs损害较模型组轻,其部分细胞核(N)呈圆形或卵圆形,形态欠规则,核膜清晰可见,核内染色质呈聚集趋势,线粒体(Mi)轻度肿胀、变形,部分内质网(ER)扩张,胞浆中细胞器种类、数量均有减少,分布较稀疏(图9)。

图1 对照组Bcl-2染色(200×) 图2 模型组Bcl-2染色(200×) 图3 给药组Bcl-2染色(200×)

表3 Bad在视网膜的表达

注：与对照组相比,▲P<0.01,△P<0.05；与给药组相比,★P<0.01

图4 对照组Bad染色 图5 模型组Bad染色 图6 给药组Bad染色

3 讨论

青光眼是眼科常见的不可逆的致盲性眼病。青光眼的致病特点就是视野缺损和视神经损伤,发病隐匿,病因复杂,发病机制至今尚未完全明了,已往青光眼的治疗主要是通过药物或者手术方式将眼内压控制在适当范围,而部分青光眼患者即使经药物或手术降低了眼压,但RGCs的凋亡、视神经的损伤仍继续发展,甚至导致视力丧失[4],因此在控制眼压的同时,阻断或降低RGCs的凋亡和增加RGCs的存活能力,已成为青光眼治疗的研究方向[5-6]。国外已有实验证明PI3K/Akt信号通路在RGCs的凋亡过程中起到抑制作用[7],但具体作用机理仍然不清楚近年来,PI3K/Akt信号通路(磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,phosphatidylinositol 3-kinase pathway/protein kinase B,PI-3K/Akt)已成为凋亡基因调控热点,PI3K/Akt信号通路促进神经元存活的作用已经得到许多研究的证实[ 8-10 ]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,普遍存在于机体内各类细胞中,Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是PI3K的活化物质,主要负责由PI3K始动的生物信息的传导,生长因子等胞外因子通过与其相应的酪氨酸激酶受体结合后,引导PI3K移动至附近的浆膜,活化的PI3K催化产生PI一3,4-P2和PIP3,后者诱导无活性的Akt和磷脂酰肌醇依赖的激酶一l(PI)K一1)转位至浆膜内表面,从而实现Akt的激活,发挥抗凋亡作用,激活后的Akt通过直接磷酸化凋亡机器组件或间接改变编码凋亡机器组件的基因表达水平,来控制凋亡过程,如:通过磷酸化抑制前凋亡蛋白Bad的活性；Bad引起细胞凋亡,与Bcl-2和Bcl-xL在线粒体外膜处结合形成异源二聚体有关。D’Agata等[11]对正常的刚刚出生、生后15d及成年大鼠眼组织研究结果证明,大鼠脉络膜丛上皮细胞、神经节细胞中均有Bad表达。吴红色等[12]研究发现,大鼠视神经钳夹伤后3d,Bad开始高水平表达,5d达到高峰,7d开始下降,Bad高水平表达促进了RGCs继发性的死亡,直到伤后14d Bad表达水平明显下降,使RGCs数目维持于稳定状态。Burne等[13]的研究显示切断轴索后,bcl-2转基因的表达保护了视网膜神经节细胞免于凋亡。因此说Bad作为细胞凋亡基因的代表,Bcl-2作为细胞生存基因的代表,两者之间表达水平的平衡结果,决定了细胞是生存还是凋亡。杨柳等[14]发现高表达的Bcl-2能够促进小鼠视神经损伤后的再生,并且再生的神经轴突在4d后长入脑内的靶组织。

图7 透射电镜观察 对照组RGCs(×12000)。细胞核(N)呈圆形或卵圆形,核膜清晰,染色质均匀,细胞器丰富、线粒体(Mi)、内质网(ER)形态正常 图8 透射电镜观察 模型组RGCs(×20000)。细胞核(N)呈圆形或卵圆形,轮廓极不规则,核膜清晰可见,核内染色质固缩,胞浆空泡化,核糖体明显减少,残存线粒体(Mi)高度膨胀、破裂,部分内质网(ER)扩张,呈空泡状 图9 透射电镜观察 给药组RGCs(×20000)。部分细胞核(N)呈圆形或卵圆形,形态欠规则,核膜清晰可见,核内染色质呈聚集趋势,线粒体(Mi)轻度肿胀、变形,部分内质网(ER)扩张,胞浆中细胞器种类、数量均有减少,分布较稀疏

青光眼是一类以特异性视神经损害和视野缺损为共同特征的眼病,类似中医“五风内障”及“青盲”,属瞳神疾病,五风内障(青光眼)基本病机为气血失和、玄府闭阻的中医理论以及病久则肝肾两亏,神光衰微甚至泯灭、不睹三光而成“青盲”(青光眼视功能损害而视神经萎缩)的病理过程,提出肝肾虚损、脉络瘀滞是青光眼视神经病理改变的主要病机,滋养肝肾、活血通络是防治青光眼视神经损害的基本方法,故本实验选取杞菊地黄丸和复方丹参片合用共奏滋补肝肾、活血化瘀之功,通过动物实验,来进一步阐述补肾活血中药在青光眼治疗方面的作用机制,拓展临床思路。我们的前期研显示[15-17]杞菊地黄丸合复方丹参片可以抑制EIOP大鼠视网膜神经纤维层(retinal nerve fiber layer,RNFL)和视网膜神经节细胞层(retinal ganglion cells layer,RGCL)变薄,改善RGCs超微结构,防止RGCs和RNFL损害,有助于多焦视网膜电图(multifocal electroretinogram,mfERG)总波及1、2、3、4环P1波反应密度、总波P1波峰潜时、2环及3环N1波反应密度,3环、4环N1波峰潜时的恢复,上调RGCs抗凋亡基因Bcl-2、抑制凋亡促进基因Bax[18],并可修复初级视皮质(primary visual cortex,PVC)及外侧膝状体(lateral geniculate nucleus,LGN)的损伤,提高EIOP大鼠PVC及LGN的BDNF表达[19-22]。临床观察[23]也发现杞菊地黄丸与复方丹参片治疗眼压控制后青光眼视功能的临床疗效良好。

本研究通过观察补肾活血中药对大鼠慢性高眼压模型视网膜PI3K/AKt通路凋亡相关因子Bcl-2及Bad的干预作用及对EIOP大鼠视网膜RGCs超微结构的影响,进一步探讨补肾活血中药对青光眼视功能保护的作用机理。结果发现补肾活血中药(杞菊地黄丸合复方丹参片)用于SD大鼠慢性EIOP模型,能降低眼压,上调Bcl-2的表达及下调Bad的表达、改善RGCs超微结构来抑制细胞凋亡,最终发挥对慢性高眼压大鼠视网膜的保护作用。杞菊地黄丸为经典古方,为滋补肝肾明目的代表方剂,复方丹参片活血化瘀通络,两者均为《中国药典》载入药品、非处方用药,可作为临床青光眼视神经保护药物推广应用。

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EffectsoftraditionalChinesemedicineofBuShenHuoXueonritinalBcl-2andBadofPI3K/AKtpathwayinratmodelofelevatedintraocularpressure

ZHANGJing1,2,LIXiang1,WANGWei3,LIUHong-ji4,LiXiang-yu4,LIHua-hong4,WANGTai4,TIANMeng-yao4,YANGFeng-jiao4

(1.DepartmentofOphthalmology,TheTeachingHospitalofChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610072;2.YanglingDemonstrationZoneHospital,Xianyang,Shanxi,712100 ;3.TraditionalChineseMedicineHospitalAffiliatedtoSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan,646000;4.ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo observe the effect of traditional Chinese medicine (TCM) of BuShenHuoXue on retinal BCL-2 and Bad in SD rat model of chronic elevated intraocular pressure,and explore it’s initial mechanism.MethodsThe rats were randomly divided into 3 groups:control group,model group and treatment group,10 rats in each group.The model of chronic EIOP was established by unilaterally cauterizing 3 episcleral vessels.After given TCM of BuShenHuoXue or normal saline for 8 weeks,the rats were put to death.The effect of intraocular pressure(IOP),expression of retinal BCL-2 and Bad,ultrastructure of RGCs were observed.ResultsCompared with pre-operation,IOP in treatment group and model group at model building until postoperation 8 weeks were increased(allP<0.01).There was obviously reduce in treatment group between postoperation 8 weeks and models building (P<0.01),While model group was not statistically significant(P>0.05).8 weeks after-modeling,the Immunohistochemical detection of retina showed that the treatment group’s expression on Bcl-2 was the highest,compared with the control group and modle group,there were statistically differences(allP<0.01),model group’s expression on Bad was the highest,compared with the treatment group and control group,there were statistically differences(allP<0.01).The ultrastructure of RGCs in the treatment group was significantly improved compared with model group.ConclusionTCM of BuShenHuoXue (QijuDihuang pills and DaShen tablets)can protect the visual function on the rat model of chronic EIOP.It mainly manifested as follows:up-regulated the expression of retinal Bcl-2,dwonregulated the expression of retinal Bad,reduced IOP slightly and improved the ultrastructure of RGCs.

Glaucoma; TCM of BuShenHuoXue(QijuDihuang pills and DaShen tablets); Retina; The rat model of chronic elevated intraocular pressure; Visual function protection; Bcl-2; Bad

国家自然科学基金(81373695/H2713);成都中医大学科技发展基金(030018024)

1.610072,四川成都,成都中医药大学附属医院；2.712100,陕西咸阳,杨凌示范区医院；3.646000,四川泸州,西南医科大学附属中医医院；4.610075,四川成都,成都中医药大学

李翔,E-mail:jeannelxiang@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.006

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