采煤沉陷区草鱼混养系统细菌数量变动与区系组成研究

柳炳俊

摘 要： 为了解采煤沉陷区不同草鱼（Ctenopharyngodonidellus）混养模式区系组成，通过围网养殖对3个不同混养模式的水体、底泥以及肠道内区系组成进行研究。结果表明，从各模式中分离出的菌株进行16S rDNA序列分析，结果分属于45个属，其中水体中细菌多样性高于底泥和肠道。不同模式之间比较，草鱼单养模式弧菌比例最高，而草鱼、鲢和鲤鱼合理混养模式菌群Shannon-wieners多样性指数最高（p<0.05），弧菌比例最低。这说明草鱼、鲢鱼和鲤鱼的三元合理混养能使系统中微生物的结构和功能得到优化，细菌群落的组成更趋于丰富化和多样化。

关键词： 采煤沉陷；异养菌；弧菌；混养；草鱼；鲢；鲤鱼

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是四大家鱼之一，是我国淡水养殖产量最大的一个种，在淡水养殖中占有重要地位[1]。目前，全国大部分地区都能养，2016年我国的草鱼养殖产量是589.88万吨，占淡水鱼养殖总产量的20.45%。然而，对草鱼的研究已涉及到生态养殖、病害防治、微生态制剂等多个方面，但是，草鱼养殖过程中仍然遭受细菌、病毒和寄生虫等引发各种各样的疾病，这些都制约草鱼集约化养殖发展[2]。本研究将系统的研究草鱼养殖体系中水、底泥和草鱼肠道内微生物群落组成及其多样性，了解致病菌比例，探索草鱼混养模式，为草鱼病害的防治提供理论基础和现实意义。

1 材料与方法

1.1放养情况

1.2

1.3 16S rDNA细菌鉴定

PCR模板的制备即煮沸法[3]，16S rDNA扩增正向引物27F：5-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3，反向引物1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。 PCR产物送上海生工进行测序，获得的序列用Blast程序与数据库中已存在的细菌16S rDNA核酸序列进行比对，对菌株定属。

2 结果

本研究从养殖水体中共分离得到279株菌，分属于41个属。其中，草鱼单养模式的优势菌属为弧菌属（Vibrio）、芽孢杆菌属（Bacillus）和短波单胞菌属（Brevundimonas），分别占的21.74%、14.51%和10.01%；草鱼和鲢鱼二元混养模式的优势菌属依次为弧菌属、短波单胞菌属和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium），其比例分别为18.92%、13.96%和10.11%；草鱼、鲢鱼、鲤鱼三元混养模式的优势菌属分别为芽孢杆菌属、弧菌属和不动杆菌属（Acinetobacter），其比例分别为12.28%、10.90%和9.52%。不难看出，弧菌属为各养殖模式水体中共有的优势种，其中单养模式中比例最高，为21.74%，三元混养模式的比例最低，为12.28%。

从养殖底泥中分离出287株菌，分属于33个属。其中，单养模式中的优势菌属分别是芽孢杆菌属、弧菌属和假单胞菌属，其比例分别为21.83%、19.12%和15.22%；二元混养模式优势属依次为芽孢杆菌属、弧菌属和假单胞菌属，其比例分别为22.24%、14.15%和12.13%；在三元混养模式中芽孢杆菌属、假单胞菌属和奈瑟菌属（Neisseria）为优势菌种，其比例分别为20.18%、12.75%和11.38%。从三个模式致病菌弧菌属所占比例分析，以草鱼单养模式比例较高，占到19.31%，三元混养模式最低，为6.63%。

从各模式草鱼肠道中共分离出225株菌，分属于28个属。其中，草鱼单养模式优势属分别是弧菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属（Staphylococcus），所占比例其为44.78%、10.58%和8.78%；草鱼和鲢二元混养模式优势菌属依次为弧菌属、芽孢杆菌属和黄杆菌属（Flavobacterium），其比例分别为29.88%、18.56%和8.59%；而芽孢杆菌属、弧菌属和气单胞菌属（Aeromonas）为草鱼、鲢鱼和鲤鱼三元混养模式的优势菌属，其比例分别为16.12%、14.33%和9.15%。各模式弧菌属所占比例为，草鱼单养模式最高，达到了44.78%，而三元混养模式最低，为14.33%。

3 结论

众所周知，草鱼为活动在水体中下层以草为食的杂食性鱼类，鲢鱼喜欢生活在水体中上层，是典型以滤食藻类为食的鱼类，而鲤鱼为水体底部的杂食性鱼类，有重要的扰动作用。通过三种鱼类的生态位不同，将三种鱼类混养，旨在探索一种科学的养殖模式。本研究结果表明，将三者混养，不仅可以在生态位上达到互补，充分利用水体空间，而且有利于促进养殖环境中微生物的多样性，优化菌群结构。三个模式之间综合比较，草鱼、鲢鱼和鲤鱼混养三元模式细菌多样性显著高于其它两个模式（p<0.05）；不论水体、底泥还是草鱼肠道，草鱼、鲢和鲤鱼三元混养模式中弧菌比例为最低，而草鱼单养模式则为最高或较高。同时，草鱼单养模式中弧菌属、葡萄球菌属、气单胞菌属和假单胞菌属在水体、底泥和草鱼肠道中均占比较大比例，而这些菌属大多是条件致病菌。通过研究我们了解到，养殖期间草鱼单养模式中草鱼的死亡率要明显高于其两个模式，尽管引起草鱼死亡的确切原因需进一步研究，但本研究从某种程度上证明了草鱼、鲢和鲤鱼按照一定比例混养能优化环境菌群区系，促进了系统中的物质循环和能量流动，具有在理论上的合理性和实践上的优越性。

参考文献

[1]Wu S， Ren Y， Peng C， et al. Metatranscriptomic discovery of plant biomass-degrading capacity from grass carpintestinal microbiomes [J]. FEMS Microbiology Ecology，2015， 91（10）： 107-111.

[2]黃灿，张忠海等.益生芽孢杆菌对草鱼肠黏膜结构的保护作用[J].水生生物学报，2017，41（4）：774-775.

[3]阳桂丹，张巨源，陈雯莉. 模板制备方法的改进[J]. 华中农业大学学报，2016，35（6）：44-51.