环孢素A和他克莫司在体外对外周血单个核细胞内乙型肝炎病毒复制的影响

张友福 罗来邦 杨华 丁利民 杨锦然 罗文峰 龙成美 李新长

摘 要 目的：探讨环孢素A（ciclosporin A， CsA）和他克莫司（FK506）在体外对外周血单个核细胞内乙型肝炎病毒复制的影响。方法：建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV-DNA）永久转染人外周血单个核细胞株，计算CsA和FK506对HBV-DNA永久转染人外周血单个核细胞株的药物安全浓度，采用狭缝印迹杂交法半定量分析细胞内HBVDNA水平。结果：CsA和FK506的药物作用安全浓度分别是≤36 μg/ml和≤200 ng/ml。在安全浓度范围内，CsA的质量浓度与细胞内HBV-DNA相对复制水平呈显著负相关（r=-0.886，P<0.05）；FK506的质量浓度与细胞内HBVDNA相对复制水平无明显相关性（r=-0.593，P>0.05）。结论：CsA在体外呈剂量依赖性地抑制外周血单个核细胞内乙型肝炎病毒复制，而FK506不具备上述特性。

关键词 环孢素A 他克莫司 乙型肝炎病毒 外周血单个核细胞

中图分类号：R373.21 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）23-0097-03

In vitro effect of ciclosporin A and tacrolimus on the replication of peripheral blood mononuclear cells mesne hepatitis B virus *

ZHANG Youfu**， LUO Laibang， YANG Hua， DING Limin， YANG Jinran， LUO Wenfeng， LONG Chengmei， LI Xinchang（Department of No.3 General Surgery， the Peoples Hospital of Jiangxi Province， Nanchang 331100， China）

ABSTRACT Objective： To discuss the effect of ciclosporin A （CsA） and tacrolimus （FK506） on the replication of peripheral blood mononuclear cells mesne hepatitis B virus in vitro. Methods： A human peripheral blood mononuclear cell line permanently transfected with hepatitis B virus deoxyribonucleic acid （HBV-DNA） was established to calculate the safe concentrations of CsA and FK506 for HBV-DNA permanently transfected human peripheral blood mononuclear cell line， and semi-quantitative analysis of intracellular HBV-DNA levels was performed by slot blot hybridization. Results： The safe concentrations of CsA and FK506 were <36 mg/ml and <200 ng/ml， respectively. Within the safe concentration range， the mass concentration of CsA was negatively correlated with the relative replication level of HBV-DNA in cells （r=-0.886， P<0.05）； the mass concentration of FK506 was not correlated with the relative replication level of HBV-DNA in cells （r=-0.593， P>0.05）. Conclusion： CsA can in vitro inhibit hepatitis B virus replication in peripheral blood mononuclear cells in a dose-dependent manner but not FK506.

KEY WORDS ciclosporin A； tacrolimus； hepatitis B virus； peripheral blood mononuclear cell

环孢素A（cyclosporin A， CsA）和他克莫司（FK506）均为常用的器官移植后免疫抑制剂。研究发现，CsA 对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV-DNA）转染人肝癌细胞的乙肝表面抗原、HBV-DNA表达具有抑制作用[1]。然而，HBV不仅存在于肝细胞中，而且存在于外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）中，PBMC内HBV成为乙型肝炎病患者肝移植术后HBV再感染的病毒来源之一[2-3]。目前，关于CsA或FK506对PBMC内HBV复制的体外实验研究却鲜有报道。为此，我院开展本研究，旨在探讨CsA和FK506在體外对PBMC内HBV复制的影响，为日后肝移植免疫抑制方案的临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

收集乙肝病毒携带者的外周静脉血，分离PBMC，将PBMC种植于10%胎牛血清（美国Gibco 公司）、100 U/ml青霉素（美国Sigma公司）的RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），置于孵箱中培养（37 ℃、饱和湿度、5% CO2），待细胞融合度达85%±5%时，用0.25%胰蛋白酶（美国Thermo Fisher Scientific公司）消化传代，待P/N值>5时，用于实验[4]。

1.2 四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl terazolium， MTT）试验

取对数生长期的PBMC，0.25%胰蛋白酶消化后稀释成2.5×104个/ml的混悬液，接种于96孔板上，200μl/孔。培养24 h后弃上清液，分別加入100 μl预先配制好的含不同浓度CsA 的培养基（0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、24.00、36.00、40.00、80.00、100.00及200.00 μg/ml）和FK506的培养基（0.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00、1000.00、2000.00、4000.00及5000.00 ng/ml），以不含药孔作对照，每个浓度设3个复孔。每隔24 h换相应药物质量浓度的新鲜培养基，培养4 d后弃上清液，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，继续培养4 h后，加入二甲基亚砜200 μl，用全自动酶标仪于570 mm处测定A值[5]。采用下列公式计算细胞存活率：细胞存活率=药物处理孔A值平均值/对照孔A值平均值×100%。

1.3 药物干预实验

取对数生长期的PBMC，胰酶消化后稀释成2.5×104个/ml的混悬液，接种于24孔板上，200 μl/孔。培养24 h后弃上清液，分别加入100 μl预先配制好的含不同浓度 CsA的培养基（0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、24.00及36.00 μg/ml）和 FK506的培养基（0.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00及200.00 ng/ml），以不含药孔作对照。每隔24 h换相应药物质量浓度的新鲜培养基，培养4 d后收集24孔板各孔培养细胞，独立保存。

1.4 HBV-DNA检测

培养细胞经磷酸盐缓冲液（氢离子浓度指数为7.8）漂洗，采用全蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）按说明书提取细胞 DNA。以所提取的DNA为模板，采用反转录试剂盒（全式金生物技术有限公司）按说明书逆转录成cDNA，以b肌动蛋白为内参，并用DNA凝胶电泳回收提纯。采用狭缝印迹杂交半定量（试剂盒购自上海罗氏制药有限公司）分析HBV-DNA复制相对水平。

1.5 统计学方法

所有数据均经SPSS 20.00统计学软件进行统计学处理。采用Pearson相关性分析药物的质量浓度与细胞内HBV-DNA相对复制水平的相关关系，检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 MTT 结果

CsA的质量浓度在0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、24.00、36.00 μg/ml 时，细胞存活率>95%。提示，CsA≤36 μg/ml对培养细胞无毒性，为药物作用安全浓度。FK506的质量浓度在0.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 ng/ml 时，细胞存活率>95%。提示，FK506≤200 ng/ml 对培养细胞无毒性，为药物作用安全浓度。

2.2 CsA和FK506在体外对细胞内HBV-DNA复制的影响

0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、24.00及36.00 μg/ml的CsA作用4 d时间后，细胞内HBVDNA相对复制水平分别为99.68、92.76、88.96、89.92、85.49、79.54、75.44、74.80及70.26%。0.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00及200.00 ng/ml的FK506作用4 d时间后，细胞内HBV-DNA 相对复制水平分别为99.46、99.72、99.83、99.65、99.49、99.20、99.50及99.30%。

CsA的质量浓度与细胞内HBV-DNA相对复制水平呈显著负相关（r=-0.886，P<0.05）；FK506的质量浓度与细胞内HBV-DNA相对复制水平无明显相关性（r=-0.593，P>0.05）。

3 讨论

HBV-DNA是观察病毒感染复制的“金标准”，HBV-DNA永久转染人PBMC细胞株能完整地表达HBV-DNA，因此是PBMC内HBV复制体外实验的理想模型[5-6]。MTT结果提示，CsA≤36 μg/ml对培养细胞无毒性，FK506≤200 ng/ml对培养细胞无毒性，为药物作用安全浓度。因此，本研究在上述药物作用浓度下观察CsA和FK506对培养细胞内HBV-DNA相对复制水平的影响。

本研究结果显示，CsA的质量浓度与细胞内HBVDNA相对复制水平呈显著负相关；FK506的质量浓度与细胞内HBV-DNA相对复制水平无明显相关性。提示，CsA能呈剂量依赖性地抑制细胞内HBV-DNA复制，而FK506对细胞内HBV-DNA复制无明显影响。有关细胞内信号传导通路的研究发现，CsA能与HBV-DNA转染人肝癌细胞中的线粒体膜通透转运复合孔结合，与该复合孔结合后能抑制该复合孔的构成亚基——亲环孢素D的催化活性，从而阻止该复合孔的构象变化，续而干扰HBV-DNA转染人肝癌细胞表达，进而抑制HBV-DNA转染人肝癌细胞复制[7-9]。FK506在HBV-DNA转染人肝癌细胞内结合蛋白质为FKBP，其介导的钙离子与信号转导与亲环孢素D不同，这可能是FK506不能抑制HBV-DNA转染人肝癌细胞复制的原因[10]。HBV-DNA转染人PBMC细胞和肝癌细胞的感染复制及致病机制完全相同[11]。笔者推测，CsA 在 HBV-DNA 永久转染人PBMC细胞中抑制HBV复制的过程与HBV-DNA 转染人肝癌细胞相同。上述论断还有待进一步研究来证实。

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