柴油降解菌的筛选及降解柴油方法的研究进展

张 瑶，汤众如，汪 涛，曹 迪，董 程

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163000；2.黑龙江八一农垦大学工程学院，黑龙江大庆 163000）

当前使用最多的发动机燃料之一是柴油，社会经济的发展使得柴油的需求量逐渐增加，土壤环境、生活环境均由于人类对柴油不合理利用所污染。柴油主要以溶解态、自由态、挥发态和残余固态存在于土壤中，破坏了土壤结构和理化性质；同时造成地下水系统污染，威胁着动植物的生存。2015年首次公布全国土壤污染状况调查公报显示，在13个采油区的494个土壤点中，23.6%为超标点位，主要污染物为石油烃和多环芳烃[1]。因此，污染土壤的修复与治理目前已成为最引人关注的话题之一。生物处理具有节约能源、投资少、运行费用低等优点，是柴油污染土壤处理的理想方式。

土壤中存在可利用有机物的微生物，它们具有氧化分解有机物的能力。在许多条件下，降解菌驯化时间长、生长慢、代谢活性低、不稳定，所以筛选稳定高效的降解污染物菌株，是生物修复的必然要求。不同油区的微生物菌种不同，最适的培养条件也不同，所以对于土壤修复技术来说，高效降解菌的筛选是必要的。

1 柴油降解菌的筛选

1.1 采样

柴油降解菌的筛选首先需要找到污染土源。污染土壤主要有2种来源：一是直接在柴油污染地采取污染土样，如胡春辉、吕乾川等人[2-3]的研究；二是利用人工模拟柴油污染土壤作为污染土样，当用人工污染土样时，污染程度和条件的设置需要考虑被修复土壤的自然环境条件，如孙秦川等人[4]是将混有柴油的土壤放置到一定深度的污染地层。由于直接使用污染土壤筛选的菌株缺乏柴油针对性，而直接用人工模拟柴油污染土壤可能又会使筛选出的菌株脱离真实环境，使其无法在野外大量生存。所以，该研究更倾向于将两者结合，即先在柴油污染地取一定量的污染土，再加入一定比例的柴油混匀，最后将混匀后的污染土壤放置到有一定深度的柴油污染地，经一段时间后挖出，作为柴油污染土样。

1.2 筛选

柴油污染土样制备完毕后，要进行菌株的筛选和纯化。实验室筛选菌株的一般步骤如下：①土壤样品富集培养；②涂布培养：样品稀释、涂布、恒温培养；③划线培养：包括交叉划线法、三区划线法等；④镜检：涂片、染色、观察。菌株的筛选操作简便，其区别之处在于涂布培养过程中固体培养基的选用不同。大多数应用的有2种：一是以柴油为唯一碳源的培养基，如马晓焉等人[5]用到的固体油培养基；二是不添加油的固体培养基，如胡春辉和吕乾川等人[2-3]用的是LB固体培养基。这2种固体培养基试验更倾向于前者，在试验过程中，用一种土样分别在2种固体培养基中进行筛选，经过降解率的测定显示，降解率最高的5株菌均是用固体油平板筛选出来的。将固体培养基中的碳源设置成仅由柴油提供，可以提高菌株筛选的针对性，为挑选降解率更高的菌株提供更大的可能性。

2 降解柴油的方法

利用筛选得到的柴油降解菌株降解柴油，可以使用不同的方法来提高降解率，从而达到最佳的降解效果。

2.1 单一菌株与复合菌群

柴油是一种混合物，轻质的石油类产品，复杂烃类混合物，饱和烷烃大约占89.6%，芳香烃大约占8.0%，柴油中还有少量的醇、烯、酸等氧化物。面对成分复杂的柴油，单菌株无法完全完成柴油降解的过程，只有使具有不同能力的微生物共同发挥作用，构成复合菌群，才可能实现柴油的完全降解。各菌株间一般存在协同与拮抗作用，在构建复合菌群时，需要考虑各菌株之间的相互关系。将降解不同组分的菌株复配在一起，可以提高降解菌株对柴油降解的效率。如陆泅进等人[6]混合菌群的柴油降解率较之单一菌株要高。

筛选得到的柴油降解菌株除了可以直接降解柴油外，无论是单一菌株还是复合菌群，都可以在原菌株的基础上对菌株进行基因改造，或者使单一菌株、复合菌群与植株复合降解柴油，这都可以增加柴油的降解率。例如，周翔等人[7]通过重离子束辐射得到了突变菌株DMYR9，使得污染土壤的修复效果明显增强；陆泅进等人[6]通过试验证明了苜蓿和芥菜都能显著地强化菌株Q18对柴油的降解，菌群和苜蓿及芥菜复合体系降解柴油的能力也高于菌群对柴油的降解。

2.2 表面活性剂

表面活性剂通过3种途径来提高柴油污染土壤的生物可利用率[8]：①增大微生物细胞与油滴的直接接触的方法；②减小油滴的直径，通过增溶作用，使有机分子溶解在胶束中，使水相中的油相分散，有利于微生物吸收比自身大小小的液滴；③改变细菌细胞的表面特征，添加低浓度的表面活性剂能使细菌细胞表面更加疏水，增加细胞与石油烃污染物之间的亲和力，从而提高细菌降解柴油污染土壤的能力。

杜海、李玉瑛等人[9-10]的试验中，表面活性剂无论是单一添加还是复合添加都能有效提高降解率，且他们均在测定降解率前将各表面活性剂对各自菌株的影响进行了报告，通过毒性试验确定表面活性剂的用量，尽可能提高菌株对柴油的降解率。在筛选菌株时，也可以直接挑选生产表面活性剂的菌株。

2.3 生物修复与物理修复的结合

利用微生物降解柴油，除了通过添加表面活性剂提高降解率外，还可以通过改变外界环境来提高微生物的降解作用。生物通风法是一种土壤原位修复的方法，将生物修复方法与物理修复方法相结合，其技术基础是土壤气相抽提技术。生物通风法将空气或氧气通过低速的通风速率输送到地下环境，促进生物好氧降解的作用，达到降解有机物的目的。还有研究者通过生物通风技术对修复不同程度的柴油污染土壤的土柱模拟试验，研究了各土柱中土壤总石油烃的去除规律，并对影响柴油去除效果的因素进行了分析，为研究不同土壤中柴油的生物降解作用提供了科学依据。

3 结语

污染土壤防治行动计划的发布和实施，是对柴油污染土壤修复工作的新要求和新目标。修复柴油污染土壤的物理、化学方法虽然具有修复周期短的特点，但存在修复不完全和容易造成二次污染等缺点；生物修复技术以其不产生二次污染、成本低等特点，近年来被大范围推广使用。但是，生物修复技术也有一定的局限性，首先是时间，想要达到预期目标需要付出长达几年的时间来完成；其次，高浓度的柴油污染物可能会使微生物的生存受到影响，自然环境的多变性同样会影响菌群的降解率。这些生物修复的局限性也预示着未来生物修复技术的发展。

随着分子遗传学和分子生物学技术的飞速发展，对柴油的生物降解的研究已经从宏观层面（如菌株筛选鉴定），到了微观的分子水平（如基因的修改）。修复柴油污染土壤的技术诞生了很多，但是技术革新是很重要的，生物修复和物理修复或化学修复结合的技术也将成为修复柴油污染土壤的趋势。