中药复方多糖对不同MHC B-LβII基因型蛋鸡禽流感抗体效价的影响

刘晓婷，朱晓庆，马 昭，乔彦杰，张保军，谷新利，商云霞

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】禽流行性感冒(Avian Iafluenza，AI)简称禽流感，是由 A 型流感病毒引起的烈性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为 A 类传染病[1]，我国将禽流感列为重大动物疫病和一类传染病[2]。近年来，由于抗生素的滥用，禽流感病毒的变异及强毒株的出现等原因[3]，在家禽生产中普遍存在疫苗接种效果不佳或免疫失败等问题[4]。有临床实践表明，疫苗与免疫佐剂或免疫增强剂配合使用，是疫苗发挥良好防疫效果的有效手段之一[5,6]。中药多糖是从中草药中提取出的具有免疫增强[7]、抗感染[8]、抗病毒[9]、调节造血功能[10]等多种生物活性作用的成分之一，它毒副作用小，残留量低，具有开发成疗效确定、性质稳定、毒副作用小的免疫增强剂的前景[11]。【前人研究进展】多糖类物质是一种T细胞依赖性抗原，能被MHC II类分子处理和呈递，进而被TCR识别，参与机体细胞免疫，亦能有效激活B淋巴细胞，诱导特异性抗体产生[12]。主要组织相容性复合体(MHC)参与机体内、外抗原的呈递，影响机体对疾病的抵抗力，是动物抗病育种的主要候选基因群之一[13]。有研究表明，鸡MHC B-Lβ基因多态性对机体免疫反应具有广泛调节作用[14,15]，且与禽类对传染性疾病的抗性高度相关[16]。有关和禽流感病毒的相关性研究目前很少，Boonyanuwat等对泰国禽流感爆发中心的抗病型鸡群和易感型鸡群进行单倍型验证，发现部分具有抗病性的泰国地方鸡种得以存活，其抗病特性与免疫遗传有关，特别是与MHC I类和MHC II类分子有关，MHC可作为与禽流感抗病相关的候选基因，也可作为提高鸡流感抗病性的遗传标记[17]。【本研究切入点】由于鸡MHCB-LβII基因的多态性的存在，使得MHC II类分子接纳与递呈抗原肽有一定的选择性，导致不同基因型个体对同一抗原表现出免疫应答强弱的差异。而中医药自古讲求用药个体化，因此中药多糖作为调节机体免疫的外源性抗原之一，根据机体遗传变异的特性给予不同剂量的中药多糖，对保障疫苗效力、增强动物机体免疫力及提高其存活率有着重要意义。【拟解决的关键问题】试验拟排除因MHCB-LβII基因多态性而导致的不同基因型个体免疫应答能力的差异，确定中药复方多糖对蛋鸡禽流感免疫效果的影响，为中草药复方多糖在蛋鸡重大动物疫病防治工作方面提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 药物

中药复方多糖由石河子大学中兽医学研究室提供。复方由当归、党参、川芎、熟地、山楂、何首乌、淫羊藿、麦冬、茯苓、补骨脂与黄芪11味中药按一定配比组成，经水提-醇沉法得到中药复方多糖粗提物后，再由AB-8大孔吸附树脂吸附解吸附，最终得到质量百分比浓度为77.10%的精制复方多糖。用灭菌超纯水将复方多糖配制成50 mg/mL(高剂量)、25 mg/mL(中剂量)、12.5 mg/mL(低剂量)3个质量浓度，4℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

鸡新城疫病毒(La Sota株)、传染性支气管炎病毒(M41株)二联灭活疫苗，购自普莱柯生物工程股份有限公司；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(La Sota 株+H120株)及鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)均购自哈药集团生物疫苗有限公司；禽流感二价灭活疫苗(H5N1 Re-6株+H9N2 Re-2株)、禽流感H9亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H9亚型阳性血清均购自哈尔滨维科生物技术开发公司；禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(Re-6株)，青岛易邦生物工程有限公司；禽流感H5亚型血凝抑制试验阳性血清、SPF鸡阴性血清均购自青岛立见诊断技术发展中心。

1.2 方 法

1.2.1 试验动物及分组

500羽1日龄京红1号蛋鸡，购自新疆昌吉市某孵化场。根据MHCB-LβII基因第2外显子PCR-SSCP的检测结果分组，再将各组分为高、中、低剂量中药多糖组和空白对照组。分别于8日龄肌肉注射50、25、12.5 mg/mL的中药复方多糖和生理盐水，每只0.2 mL，连续注射7 d。

所用试验鸡1日龄马立克疫苗喷雾免疫(于孵化场进行)，7日龄新、传二联活疫苗点眼免疫，21日龄新、传二联活疫苗点眼与新、传二联灭活苗肌注免疫，14日龄法氏囊疫苗滴口免疫，28日龄禽流感二联灭活苗免疫。在相同条件下常规饲养，饲养条件、营养水平和饲养管理均一致，饲养期为7周，整个试验期鸡群健康状况良好。

1.2.2 PCR-SSCP基因型检测1.2.2.1 基因组DNA的提取

翅下静脉采血0.2 mL/羽，置于肝素钠抗凝采血管中摇匀，-20℃冷冻保存。用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，2%琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃保存备用。

1.2.2.2 引物设计与合成

根据GenBank中收录的鸡MHC B-LβⅡ基因序列(NO.M29763.1)，应用Oligo软件设计引物，引物序列为：上游引物：5’-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3’，下游引物：5’-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3’，扩增片段238 bp，引物由华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2.3 PCR扩增

1.2.2.4 PCR-SSCP分析及序列测定

取3 μL PCR产物加7 μL 变性上样缓冲液(98%去离子甲酰胺、10 mmol /L EDTA (pH 8.0)、0.05%溴酚蓝)，98℃变性10 min，变性结束后迅速置于冰上冰浴10 min。用10%聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Scr=29∶1)电泳检测，300 V电压预电泳10 min，120 V电泳14 h后，固定、银染、显色，判定基因型，拍照保存。各取3个不同基因型个体的PCR产物进行纯化回收，送华大基因科技股份有限公司进行测序，对PCR-SSCP分型结果进一步验证。

1.2.2.5 检测项目

每组随机抽取5只试验鸡，于27、35、42、49日龄翅下静脉采集非抗凝血3 mL，37℃静置1 h，分离血清，用微量血凝抑制试验(HI)检测血清中H5与H9亚型禽流感抗体效价。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析和多重比较，数据以“x±SD”表示。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

用所设计的引物对基因组DNA进行扩增，取所得PCR产物5 μL于2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，扩增产物检测结果表明，所设计引物的扩增结果较好，片段长度与预期238 bp大小一致，条带清晰、无非特异性条带，可直接进行SSCP分析。图1

注：M，Trans DNA Marker I；1～7，MHCB-LβIIPCR扩增产物

Note: M, Trans DNA Marker I; 1-7, PCR products ofMHCB-LβII

图1 MHC B-LβⅡ的PCR扩增结果
Fig.1 The PCR amplification results of MHC B-LβII

2.2 SSCP检测

对所有DNA样本的PCR产物进行SSCP多态性检测，发现所扩增片段有3种基因型，分别定义为AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)。图2

注：1、6、8、10：BC型；2、4、7、9：BB型；3、5：AA型

Note: 1、6、8、10:BCgenotype; 2、4、7、9:BBgenotype; 3、5;AAgenotype

图2 部分试验鸡MHC B-LβⅡ基因型的PCR-SSCP检测
Fig.2 PCR-SSCP detection of MHC B-LβⅡ genotype in partial hen

2.3 中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型H5亚型禽流感抗体效价的影响

研究表明，免疫前各剂量中药复方多糖组H5N1 Re-6母源抗体平均效价高于对照组，且高剂量组AA和BC型鸡血清H5N1母源抗体效价显著高于对照组(P<0.05)。AA基因型鸡中，免疫后7 d，高、中、低三个剂量组的H5亚型禽流感抗体效价均显著高于对照组(P<0.05)；免疫后14～21 d，中药复方多糖组的抗体效价略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。BB基因型鸡中，高剂量和中剂量组的H5亚型禽流感抗体效价较高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。BC基因型鸡中，免疫后7 d，高剂量组显著高于对照组(P<0.05)，而中、低剂量组仅略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)；免疫后14 d，各组间无显著差异(P>0.05)；免疫后21 d，高、中剂量组显著高于对照组(P<0.05)，而低剂量组仅略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。表1

表1 中药复方多糖下不同MHC B-LβⅡ基因型京红1号蛋鸡H5亚型禽流感抗体效价
Table 1 Effects of Chinese Herbal Compound Polysaccharides on Antibody titers of H5 Subtype Avian Influenza in Different MHC B-LβⅡ Genotypes of Jinghong 1 layer

log2

注：同基因型组中，同列数据不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

Notes:In the same genotype group,different lowercase lettters in the same column mean significant difference(P<0.05).The same as below

2.4 中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡H9亚型禽流感抗体效价的影响

研究表明，免疫前各剂量中药复方多糖组H9N2母源抗体平均效价均高于对照组，且高剂量组AA和BC型鸡血清H9N2母源抗体效价显著高于对照组(P<0.05)。AA基因型鸡中，免疫后7 d，高、中、低三个剂量组H9亚型禽流感抗体效价均略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)；免疫后14 d，高、中剂量组抗体效价显著高于对照组(P<0.05)，且提前一周达到7 log2；免疫后21 d，各组间无显著差异。BB基因型鸡中，除免疫后14 d中剂量组显著高于对照组外(P<0.05)，其他日龄各剂量组抗体效价虽高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。BC基因型鸡中，高剂量组中母源抗体效价显著高于空白对照组(P<0.05)，免疫后7 d，各剂量中药复方多糖组均显著高于对照组(P<0.05)；免疫后14 d，中剂量组显著高于对照组(P<0.05)，高、低剂量组略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)；免疫后21 d，高剂量组显著高于对照组(P<0.05)，中、低剂量组略高于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。表2

表2 中药复方多糖下不同MHC B-LβⅡ基因型京红1号蛋鸡H9亚型禽流感抗体效价
Table 2 Effects of Chinese Herbal Compound Polysaccharides on Antibody titers of H9 Subtype Avian Influenza in Different MHC B-LβⅡ Genotypes of Jinghong 1 layer

log2

3 讨 论

3.1 MHC B-LβⅡ基因多态性与蛋鸡禽流感抗体效价的关联性

由于MHC 分子的生物特异性和高度多态性，MHC B-L基因常被作为研究鸡抗病能力的候选基因。吴春梅等[18]分析 MHC B-F区基因外显子2的多态性与免疫性状的相关性时，在来航蛋鸡与北京油鸡群体中均发现了多个SNPs位点与AI和ND抗体滴度相关，说明 MHC B-F 区基因外显子2与AI和ND抗原的抗体产生有着较强的相关性。刘立波等[19]研究了鸡MHC B-Lexon2基因多态性和血清AI抗体滴度相关性，结果表明与AI抗体滴度相关的SNP位点有多个，且有多种优势单倍型。研究对京红一号蛋鸡MHC B-LβⅡ基因的多态性与蛋鸡H5与H9亚型禽流感抗体效价进行了关联分析，发现在免疫后7 d，H5与H9抗体在AA型组比BB和BC型组产生速度较快，而随着免疫时间的增长，BB和BC型组抗体效价产生的速度快于AA型组；在免疫后21 d， H9亚型禽流感抗体效价在BB型组的显著高于AA和BC型组，而H5亚型禽流感抗体效价在三个基因型组间并无显著差异，这提示MHC B-LβⅡ基因多态性与机体产生禽流感H5与H9抗体的能力可能具有一定的相关性，MHC B-Lβ Ⅱ基因的多态性会引起机体对禽流感疫苗产生免疫应答能力的个体差异。

3.2 中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型蛋鸡禽流感抗体效价的影响

近年来许多研究发现，中药多糖，特别是由补益类中草药中提取的多糖具有增强机体免疫能力，从而提高机体抗病力的作用。抗体效价是监测机体免疫状况、抗感染能力的一项重要指标，一般机体抗体效价的高低可以直接地反应机体体液免疫的强弱。刘永华等[20]研究表明，一定范围内的高剂量牛膝多糖能够提高雏鸡的禽流感抗体滴度，对雏鸡禽流感免疫有一定的促进作用。刘昭等[21]在雏鸡饲料中添加不同剂量的生地提取物，连续给药一周，结果发现不同剂量的生地提取物均可有效增强H9亚型禽流感疫苗的免疫效果，且以中剂量效果最佳。李星艳等[22]在研究复方中药多糖、黄芪多糖、当归多糖、淫羊藿多糖对禽流感抗体效价的影响时，发现复方中药多糖可提高雏鸡H5亚型禽流感抗体效价，且效果优于其它单味药多糖组。研究结果显示，与对照组相比不同剂量的中药复方多糖均能提高各基因型组蛋鸡血清中H5和H9亚型禽流感抗体效价，且对H9亚型的敏感度要优于H5亚型，与刘昭和李星艳等结果一致。与此同时，试验发现除同一时间同一剂量中药复方多糖对不同基因型的两种抗体效价影响不同外，同一时间不同剂量中药复方多糖对同一基因型的两种抗体效价影响也不相同。其中，在免疫后7 d，高、中、低三个剂量的复方多糖均可显著提高AA型组的H9亚型禽流感抗体效价与BC基因型组的H5亚型禽流感抗体效价，而对BB基因型组的H5和H9亚型禽流感抗体效价虽均有提高，但并无统计学差异。在免疫后14 d，高剂量中药复方多糖能够显著提高AA型组的H9亚型禽流感抗体效价，中剂量中药复方多糖能够显著提高AA、BB和BC型组的H9亚型禽流感抗体效价，高、中、低三个剂量的复方多糖对AA、BB和BC三个基因型的H5亚型禽流感抗体效价虽均有提高，但并无统计学差异。出现这一现象的可能原因是MHC B-LβⅡ基因多态性使机体存在免疫应答能力的个体差异，导致同一时间段内中药复方多糖对提高机体血清中AI抗体效价的最适基因型不同；另一方面可能是由于不同MHC B-LβⅡ基因型鸡的免疫调节系统对中药复方多糖这种外来抗原在数量与浓度上存在敏感性的差异，过高或过低的中药多糖均不会产生较好的免疫应答，从而引起抗体效价的差异；另外，可能也与中药复方多糖在机体内的代谢过程有关，在此过程中多糖被降解成寡糖、低聚糖等小分子形式被MHC class Ⅱ类分子提呈给T细胞而发挥免疫效应，多糖浓度的不同与机体对多糖降解、吸收和代谢速度的不同，多糖在体内被降解成小分子糖的种类和数量的不同，以及不同机体MHC classⅡ类分子提呈多糖分子数量和能力的不同，这多方面的作用导致机体血清中AI抗体效价不同。

4 结 论

蛋鸡MHC B-LβⅡ基因的多态性与机体产生禽流感抗体效价的能力可能具有一定的相关性，它能引起机体对禽流感疫苗产生免疫应答能力的个体差异。通过对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡H5及H9亚型禽流感抗体效价变化的比较，证明了肌注不同剂量的中药复方多糖可以不同程度的提高各基因型组蛋鸡血清中H5和H9亚型禽流感抗体效价，但整体上对H9亚型的敏感度要优于H5亚型，且中剂量和高剂量中药复方多糖的效果好。

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[1] Bouvier, N. M., & Palese, P. (2008). The biology of influenza viruses.Vaccine, 26 Suppl 4(Suppl. 4), D49.

[2] 甘孟侯. 禽流感[M]. 北京: 北京农业大学出版社, 1995.

GANG Meng-hou.(1995).BirdFlu[M]. Beijing: Beijing Kasetsart University Press. (in Chinese)

[3] Li, C., Yu, K., Tian, G., Yu, D., Liu, L., & Jing, B., et al. (2005). Evolution of h9n2 influenza viruses from domestic poultry in mainland China.Virology, 340(1): 70-83.

[4] 张毅, 王幼明, 王芳, 等. 我国禽流感研究进展及成就[J].微生物学通报,,2014, 41(3): 497-503.

ZHANG Yi, WANG You-ming, WANG Fan, et al. (2014). Progress and achievements in the research on avian influenza in China [J].Microbiology, 41(3): 497-503. (in Chinese)

[5] 唐应华, 陆吉虎, 吴培培, 等. 免疫增强剂对不同肉鸡禽流感疫苗免疫效果探讨[J].中国家禽, 2016, 35(16): 50-51,54.

TANG Ying-hua, LU Ji-hu, WU Pei-pei, et al. (2016). Study on Immune Effect of Immune Enhancers on Avian Influenza Vaccine in Different Broilers [J].ChinaPoultry, 35(16): 50-51,54. (in Chinese)

[6] 田震. 免疫增强剂对H9N2亚型禽流感疫苗免疫的影响[D]. 南京:南京农业大学硕士学位论文, 2013.

TIAN Zhen. (2013).InfluenceofImmuneEnhanceronH9N2SubtypeAvianInfluenza[D]. Master Thesis. Nanjing Agricultural University, Nanjing. (in Chinese)

[7] 罗燕, 邵永斌, 谷新利, 等.淫羊藿多糖对鸡免疫功能及疫苗免疫效果的影响[J].中国家禽, 2009, 31(1): 22-24.

LUO Yang, SHAO Yong-bin, GUO Xin-li, et al. (2009). Effects of Epimedium Herb Polysaccharides on the Immunity Function and Vaccination in Chickens [J].ChinaPoultry, 31(1): 22-24. (in Chinese)

[8] 陈希文,赖守勋,尹苗, 等. 22种中药多糖对猪源金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性[J]. 江苏农业科学， 2016, 44(9):264-267.

CHEN Xi-wen, LAI Shou-xun, YIN Miao, et al. (2016). In Vitro Antifungal Activity of 22 Kinds of Chinese Medicine Polysaccharides on Staphylococcus aureus in Pigs [J].JiangsuAgriculturalSciences, 44(9):264-267. (in Chinese)

[9] 王春花. 抗新城疫病毒中药多糖的筛选[D]. 哈尔滨：东北农业大学硕士学位论文, 2010.

WANG Chun-hua. (2010).Screenoutanti-NDVPolysaccharidesExtractedfromtheChineseHerbs[D]. Northeast Agricultural University, Harbin. (in Chinese)

[10] 张颖. 白芨多糖对骨髓造血及免疫功能的作用研究[D]. 重庆：重庆医科大学硕士学位论文,2009.

ZHANG Ying. (2009).EffectofPolysaccharidefromBletillastriataonHematopoiesisandImmuneFunctioninBoneMarrow[D]. Master Thesis. Chongqing Medical Univerisity, Chongqing. (in Chinese)

[11] 刘蓉蓉. 香菇多糖的安全性和增强免疫活性的研究[D]. 南京:南京农业大学硕士学位论文,2014.

LIU Rong-rong. (2014).StudyonSecurityandImmune-enhancingActivityofLentinan[D]. Master Thesis. Nanjing Agricultural University, Nanjing. (in Chinese)

[12] Cobb, B. A., Wang, Q., Tzianabos, A. O., & Kasper, D. L. (2004). Polysaccharide processing and presentation by the mhcii pathway.Cell,117(5): 677-687.

[13] Issazadeh, S., Kjellén, P., Olsson, T., Mustafa, M., & Holmdahl, R. (1997). Major histocompatibility complex-controlled protective influences on experimental autoimmune encephalomyelitis are peptide specific.EuropeanJournalofImmunology, 27(6): 1,584-1,587.

[14] 李福伟, 李淑青, 逯岩, 等. 三个地方鸡种 MHC B-L BII 基因遗传变异与免疫性状的关联分析[J].生物工程学报, 2013, 29(7): 904-913.

LI Fu-wei, LI Shu-qing, LU Yan, et al. (2013). Relations among immune traits and M HC B-L BII genetic in three local chicken breeds [J].ChineseJournalofBiological, 29(7): 904-913. (in Chinese)

[15] 朱晓庆, 谷新利, 乔海博.主要组织相容性复合体(MHC)B-L βII基因Hin II 位点多态性对鸡免疫功能的影响[J].农业生物技术学报, 2013,21(5):570-578.

ZHU Xiao-qing, GU Xin-li, QIAO Hai-bo. (2013). The Effects of Chicken Major Histocompatibility Complex (MHC) B-LβⅡGene Hin1ⅠLocus Polymorphism on Immune Function [J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 21(5): 570-578. (in Chinese)

[16] 李国勤, 卢立志, 王得前, 等.鸡MHC与传染性疾病遗传抗性的相关性研究进展[J].遗传, 2006, 28(7): 893-898.

LI Guo-qin, LU Li-zhi, WANG De-qiang, et al. (2006). Advance in Association Studies of Major Histocompatibility Complex (MHC) Gene Polymorphisms with Traits of Resistance against Infectious Disease in Chickens [J].Hereditas(Beijing) , 28(7): 893-898. (in Chinese)

[17] Boonyanuwat, K., Thummabutra, S., Sookmanee, N., Vatchavalkhu, V., Siripholvat, V., & Mitsuhashi, T. (2006). Influences of mhc class ii haplotypes on avian influenza traits in thai indigenous chicken.JapanesePoultryScience, 43(2): 120-125.

[18] 吴春梅. 鸡MHC B-F区基因SNPs分子标记与免疫性状关系的研究[D]. 扬州：扬州大学, 2007.

WU Chun-mei. (2007).StudyontheRelationshipbetweenSNPsMolecularMarkerandImmuneTraitsinChickenMHCB-Fregion[D]. PhD Thesis. Yangzhou University, Yangzhou. (in Chinese)

[19] 刘立波. 中外鸡种MHC B-L 基因遗传变异及与免疫性状关系的研究[D].北京：中国农业科学院博士学位论文, 2009.

LIU Li-bo. (2009).GeneticvarianceAnalysisoftheMHCB-LGeneinDifferentChickenBeeedanditsAssociationwithImmuneTraits[D]. PhD Thesis. Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing. (in Chinese)

[20] 刘永华, 苏 杭, 杨 松. 牛膝多糖对雏鸡禽流感免疫效果的影响[J].饲料研究, 2014, (9): 52-54.

LIU Yong-hua, SU Hang, YANG Song. (2014). Effects of Achyranthes bidentata Polysaccharides on Avian Influenza Vaccine in Chicks [J].FeedResearch, (9): 52-54. (in Chinese)

[21] 刘昭, 陈立功, 武现军, 等. 生地提取物对雏鸡免疫器官指数和H9疫苗免疫效果的影响[J].中国畜牧兽医, 2016, 43(7): 1 780-1 784.

LIU Zhao, CHEN Li-gong, WU Xian-jun, et al. (2016). Effect of Radix rehamanniae Extract on Immune Organ Indexes and H9 Vaccine Immune Efficacy of Chicks [J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 43(7): 1,780-1,784. (in Chinese)

[22] 李星艳, 罗 燕, 谷新利. 复方中药多糖对禽流感抗体水平的影响[J].黑龙江畜牧兽医(科技版), 2009, (2): 102-104.

LI Xin-yang, LUO Yang, GU Xin-li. (2009). Effect of Compound Chinese Medicine Polysaccharide on Avian Influenza Antibody Level [J].HeilongiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine, (2): 102-104. (in Chinese)