“火郁发之”法火针对大鼠急性痛风性关节炎NALP3炎性体的影响

谢丽琴 黄应杰 卢翠娜 李丽霞

（广东省广州市中医医院，广东 广州 510130）

随着人们物质生活的提高，饮食结构也随之改变，高嘌呤食物摄入较以往明显增多，各种代谢性疾病也随之高发，其中痛风性关节炎的发病率明显升高。2013年我国有相关的流行病学调查显示，在男性当中，高尿酸血症的患病率为16.85%～18.32%，痛风性关节炎的患病率为0.83%～1.98%；而女性约高尿酸血症患病率为7.88%～9.30%，痛风性关节炎患病率为0.07%～0.72%［1-2］。我国目前痛风性关节炎的患病率在1%～3%，且呈逐年上升趋势［3］。痛风性关节炎急性发作期，尿酸钠结晶沉积在关节软骨、滑膜内或关节周围时，机体立即启动第一道免疫防线。而嗜中性粒细胞碱性磷酸酶 3（NALP3）、白细胞介素-1β（IL-1β）是尿酸盐促发急性关节炎症的启动因子，是启动机体自发炎症反应的重要分子事件［4］。 所以，有效控制 NALP3、IL-1β水平是治疗急性痛风性关节炎的关键所在。本研究通过动物实验，观察火针治疗对急性痛风性关节炎大鼠模型治疗前后NALP3、IL-1β水平的影响，探索“火郁发之”法火针治疗急性痛风性关节炎在治疗急性炎症以及影响急性炎症启动的作用机制，推测“火郁发之”法火针治疗急性痛风性关节炎的可能机理，为“火郁发之”法火针治疗“火郁”证提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用60只8周龄的雄性Wistar SPF大鼠，由广州中医药大学动物实验中心提供，体质量（330±20） g，许可证编号：SCXX（粤）2013-0020。

1.2 材料与试剂 尿酸钠溶液 （美国Sigma公司，批号：201502）；氧嗪酸钾混悬液（上海tci科技有限公司，批号：YQ34L-TN）；秋水仙碱混悬液（云南植物药业有限公司，批号：国药准字H53020166）；IL-1β一抗，兔抗鼠IL-1β（产品编号：BA2782，博士德生物技术有限公司提供）；NALP3一抗，兔抗鼠NLRP3（产品编号：DF7438，美国 Affinity抗体公司提供）；IL-1β ELISA试剂盒 （武汉华美有限公司，货号：CSB-E08055r）；NALP3 ELISA试剂盒 （武汉优尔生科技股份有限公司，货号：SEK115Ra）。

1.3 主要仪器 LEICA RM2O15型切片机（德国Leica公司，RM2015）、YX400AI高压蒸汽消毒器、低温高速离心机、电热恒温干燥箱、BK-DM500型数码生物显微镜（重庆奥特，BK-DM500型）、计算机图像处理分析系统（IPP6.0病理图像分析软件）。

1.4 分组与造模 将60只Wistar大鼠使用Excel进行随机分组，分为正常组、模型组、火针组、针刺组与秋水仙碱组各12只。统一饲养，定期清洁、消毒。高尿酸血症+急性痛风性关节炎模型，参照Coderre+氧嗪酸钾的方法［5-6］造模。 1）制备高尿酸血症（HUA）模型：除正常组外，其他4组大鼠在实验的第1～10日使用1.0 g/kg氧嗪酸钾溶液灌胃，每日1次；第11～20日使用1.5 g/kg氧嗪酸钾溶液灌胃，每日1次。第20日造模完成后，5组大鼠分别抽取3只，心尖抽血检测血尿酸水平，与正常组对照，评估高尿酸血症模型造模是否成功，并分别留取两后足关节，用于测关节形态学、IL-1β及NALP3水平的检测。2）制备急性痛风性关节炎（AGA）模型：除正常组外，在第20日高尿酸血症造模完成后，立即停止氧嗪酸钾溶液灌胃。在第23日予10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，剂量按0.35 mL/100 g计算，麻醉后开始制备急性痛风性关节炎模型。制备模型方法：使用1 mL注射器，在大鼠右侧后肢踝关节后侧穿入至跟腱内侧，注射尿酸钠溶液0.2 mL即可。正常组在大鼠右侧后肢踝关节后注入等量的生理盐水。在注射尿酸钠溶液24 h后，随机抽取各组大鼠3只，取右后足外关节，用于测关节形态学、IL-1β、NALP3的水平，以评估AGA造模情况。

1.5 干预方法 正常组：不造模，不治疗。模型组：造模，不予任何治疗手段。火针组：在高尿酸血症造模后的第6小时开始予火针治疗干预。主穴取制备急性痛风性关节炎模型的右后肢踝关节病症处；配穴为行间、太冲、内庭、陷谷、曲池、合谷、阳陵泉、阴陵泉（定位参照余曙光、徐斌主编的 《实验针灸学》的大鼠针灸穴位），每次选取3个配穴。方法：采用安尔碘消毒穴位，将毫火针（刘氏毫火针，规格：直径0.35 mm，长30 mm，标准号：GB2024-94苏食药监械生产许2001～0665号）在酒精灯的外焰加热针体，烧至通红后，迅速准确地刺入穴位，深度控制在0.1～0.2 cm之间，火针点刺完毕后用跌打万花油外涂针孔；以覆盖病灶为度；每日1次，7次为1疗程。针刺组：在高尿酸血症造模后第6小时开始针刺干预治疗，取穴同火针组，方法：在穴位上用安尔碘消毒，选用直径0.3 mm，长25 mm针灸针（佳键医疗，生产许可证编号：苏食药监械生产许20060095号），针刺穴位，深度约 0.1～0.2 cm，行捻转泻法后出针；每日治疗1次，7日为1疗程。太冲：后肢第1、第2跖骨间凹陷处。内庭：后肢第2、第3跖趾关节后缘。曲池：桡骨近端的关节外侧前方凹陷中。合谷：前肢第1、第2掌骨之间。阴陵泉：在小腿胫骨内侧髁后方的凹陷处。阳陵泉：据后三里上外侧5 mm［7］。秋水仙碱组：在高尿酸血症造模后的第6小时开始按0.48 g/kg剂量给药，将秋水仙碱混悬液溶于2 mL蒸馏水中，灌胃治疗；每日1次，7 d为1疗程。以上各组共治疗1个疗程。

1.6 标本采集 造模开始前第1日，随机抽取各组大鼠3只，心尖抽血测尿酸（UA）。第20日高尿酸血症造模结束后，随机抽取各组大鼠3只，心尖抽血测UA，评价高尿酸血症模型；取两后足关节，用于测关节形态学、IL-1β及NALP3的水平。第23日关节注射MSU后24 h，随机抽取各组大鼠3只，取右后足外关节，用于测关节形态学、IL-1β、NALP3的水平。继续用药观察，第26日给药1 h后，将剩余各组大鼠心尖取血检测UA；取右后足关节，用于测关节形态学、IL-1β及NALP3的水平。

1.7 观察指标 1）一般情况：造模前、造模后第24小时、48小时、72小时观察大鼠，记录大鼠的毛色、光泽、活跃程度等一般情况。2）大鼠血液UA检测：采用尿酸Elisa试剂盒，严格参照说明书步骤操作。3）关节滑膜组织形态学检查：镜下关节滑膜组织形态学检查，评分标准根据文献改良［8］，以宏观评价治疗干预组疗效。

1.8 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用方差分析，计数资料采用 χ2检验，等级比较秩和检验，多因素相关回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 实验饲养期间，各组大鼠毛色光泽，性情温顺、正常进食；造模后，各大鼠除正常组外，其余各鼠毛色变粗、黄暗，烦躁不安，具有攻击性。

2.2 基线资料 本实验各组大鼠造模前体质量正常组为（302.20±13.00） g，模型组为（298.70±20.00） g，火针组为（300.60±16.00）g，秋水仙碱组为（296.90±19.00）g。经统计学分析，各组体质量差别不大 （P＞0.05）。

2.3 各组血浆UA水平比较 见表1。结果示，造模前各组大鼠UA水平差别不大（P＞0.05）。在第20日高尿酸血症模型造模结束，抽血结果提示造模各组UA水平较正常组升高，由此可推论各组高尿酸血症造模成功。但是组内比较，只有火针组及秋水仙碱组较造模前血UA水平升高（P＜0.05），模型组与针刺组与造模前血UA水平比较，差别不大（P＞0.05），推测可能与本实验样本量较小（每组3只）有关。在急性痛风性关节炎模型造模结束后立即予相应干预手段治疗7 d，疗程结束后，各组UA水平均较前降低，组间比较差别不大（P＞0.05）。由此可见各组干预治疗均有效，治疗后血UA水平与正常组无显著差异，且各组疗效相当，各组血UA水平组间比较无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 造模前后及治疗干预后各组间UA水平（mg/dL，±s）

表1 造模前后及治疗干预后各组间UA水平（mg/dL，±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与本组造模前比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

组 别 n 第26日疗程结束后正常组 3 2.16±0.18模型组 3 2.12±0.26火针组 3 2.60±0.53△第1天（造模前） 第20日（造模后）1.43±0.29 1.93±0.37 1.75±0.65 4.87±1.16*1.47±0.28 4.36±0.74*△针刺组 3 2.38±0.57 1.53±0.14 3.39±0.32*秋水仙碱组 3 1.76±0.58 6.64±1.55**△ 2.82±0.23△

图1 各组大鼠各阶段踝关节滑膜（HE染色，400倍）

2.4 各组关节滑膜组织病理形态学比较 见图1。正常组各个阶段的关节表面均光滑，滑膜组织未见增生及炎性细胞浸润。其余4组在高尿酸血症模型造模后均可见关节滑膜组织增生，并伴少量炎性细胞浸润；在急性痛风性关节炎模型造模后，各组关节腔均可见大量炎性细胞浸润。在疗程结束后，火针组、针刺组及秋水仙碱组大鼠关节滑膜细胞轻度增生，仅少量炎性细胞浸润；其中火针组和秋水仙碱组病理改变不明显，而针刺组病理改变较前改善。模型组在急性痛风性关节炎模型造模后及疗程结束后均可见关节腔内大量炎性细胞浸润。

2.5 各组关节滑膜NALP3、IL-1β水平比较 见表2。正常组不造模，不干预；在实验第20日AGA造模前，每组取3只大鼠，留取关节滑膜标本检测。结果示，模型组、火针组、针刺组、秋水仙碱组关节滑膜中NALP3、IL-1β水平与正常组比较，均明显升高（P＜0.05）。在实验的第23日，也就是给予干预治疗的3 d，复制AGA模型后留取标本。结果示造模的4组关节滑膜的NALP3、IL-1β水仍处于较高水平，且与正常组比较差异显著（P＜0.05）；但与模型组相比较，有干预手段治疗的火针组、针刺组、秋水仙碱组关节滑膜NALP3、IL-1β水平明显低于模型组（P＜0.05）。在实验的第26日，即治疗干预结束后，模型组NALP3、IL-1β水平明显高于其余4组，与正常组比较差异有统计学意义（P ＜0.05）；火针组、针刺组、秋水仙碱组 NALP3、IL-1β水平与正常组比较差别不大（P＞0.05），且3组间比较差别不大 （P＞0.05）。HUA造模的4组大鼠关节滑膜NALP3、IL-1β水平升高可能是尿酸盐沉积刺激导致；治疗3 d后，给予干预治疗的3组大鼠关节滑膜NALP3、IL-1β水平已开始下降，但仍高于正常组；在疗程结束后，干预治疗的3组大鼠关节滑膜NALP3、IL-1β水平下降明显，与正常组比较差别不大，3组间比较亦差别不大（均P＞0.05），而没有干预治疗的模型组NALP3、IL-1β水平则居高不下，说明3种干预治疗手段均有显著疗效，且疗效相当。

表2 各组关节滑膜大鼠各时间段IL-1β与NALP3水平比较（ng/L，±s）

表2 各组关节滑膜大鼠各时间段IL-1β与NALP3水平比较（ng/L，±s）

组 别 时 间 IL-1β NALP3正常组 第20日（AGA造模前） 0.193±0.012 0.150±0.010（n＝3） 第 23 日（AGA 造模后） 0.207±0.012 0.167±0.006第26日（疗程结束后） 0.247±0.015 0.197±0.006模型组 第20日（AGA造模前） 0.410±0.010** 0.417±0.012*（n＝3） 第 23 日（AGA 造模后） 0.393±0.029** 0.410±0.000*第26日（疗程结束后） 0.413±0.006** 0.417±0.006*火针组 第20日（AGA造模前） 0.310±0.026** 0.267±0.015*（n＝3） 第 23 日（AGA 造模后） 0.297±0.021*△ 0.300±0.000*△第 26日（疗程结束后） 0.260±0.010△ 0.260±0.000△针刺组 第20日（AGA造模前） 0.323±0.015* 0.330±0.036*（n＝3） 第 23 日（AGA 造模后） 0.323±0.029*△ 0.337±0.023*△第 26日（疗程结束后） 0.310±0.020△ 0.327±0.006△秋水仙碱组 第20日（AGA造模前） 0.270±0.010* 0.220±0.000*（n＝3） 第 23 日（AGA 造模后） 0.253±0.006*△ 0.257±0.006*△第 26日（疗程结束后） 0.263±0.015△ 0.257±0.029△

3 讨 论

痛风性关节炎病可归属于中医学“痹证”“历节”等范畴，其临床表现以关节的红、肿、热、痛为主。元代医家朱丹溪最早提出“痛风”病，在其著作《格致余论》中列有“痛风”专篇，对其病因病机有详细阐述，认为“痛风者，大率因血受热已自沸腾，其后或涉冷水，或立湿地……寒凉外搏，热血得寒汗浊凝滞，所以作痛”，其在《丹溪心法》云“肥人肢节痛，多是风湿与痰饮流注经络而痛”［9］。历代医家认为湿浊、瘀毒积热流注关节经络，不通则痛，郁而化火，故见关节红肿热痛，屈伸不利等，治疗当清利湿热，活血化瘀，疏通经络为主。《素问·六元正纪大论》云“木郁达之，火郁发之，土郁夺之，金郁泄之，水郁折之”。针对火郁之证，治疗应当因势利导，顺势而解之、散之、升之、扬之，就如开其窗，如揭其被，使得邪有出路。火针，即古代的“燔针”，明代·高武《针灸聚英》探讨了火针功效，“一为引气之功，二为发散之功”，书中云“火针亦行气，火针惟借火力，无补泄虚实之害”。痛风性关节炎急性发作期，多由于机体正气不足，外邪侵袭机体，湿邪瘀毒等邪气正盛，痹阻经脉，不通则痛。火针的这种“引气”和“发散”之功，使得气机通畅，引邪外出，达到通经活络止痛的功效。现代研究认为［10-11］，火针疗法具有“火郁发之”的功效，针对临床常见的“火郁”证，可施以火针疗法。故在“火郁发之”理论指导下，针对急性痛风性关节炎引起的关节红肿、发热，临床上常以火针疗法以热引热，点刺放血泻热，可迅速缓解关节症状。

通过对各组大鼠关节滑膜组织病理形态学的观察发现，AGA造模后关节腔内可见大量炎性细胞浸润，表明造模成功，经火针、针刺、秋水仙碱等干预治疗后，关节腔内炎性细胞均明显减少，表明干预治疗有效；而未经干预治疗的模型组则仍可见大量炎性细胞浸润。本实验结果提示，火针疗法治疗急性痛风性关节炎有效，并可有效抑制痛风性关节炎模型大鼠NALP3的活化及IL-1分泌的作用，其效果与针刺及秋水仙碱相当。对于继续痛风性关节炎的发病机制，现代医学有较多的相关研究，普遍认为急性痛风性关节炎发作时与尿酸盐结晶在关节及软组织的沉淀有关［12］。当尿酸盐结晶在关节腔内沉淀后，即可刺激大量炎性细胞吞噬尿酸盐结晶，可致关节腔滑膜表面充血、水肿［13］。本实验也证实在急性痛风性关节炎模型造模后，通过对关节滑膜病理形态学检查发现，各组关节腔均可见大量炎性细胞浸润。尿酸盐结晶被吞噬细胞、白细胞吞噬后，可破坏细胞的溶酶体等细胞器，释放出蛋白水解酶，激活组胺和趋化因子等物质，引起局部血管扩张和通透性增加，血浆渗出，白细胞聚集的炎症反应，炎症细胞释放白介素和肿瘤坏死因子等细胞因子，激活环氧化酶-2合成前列腺素，使炎症范围扩大［14］。而该炎症反应是以IL-1β激活为标志的［15］IL-1β的激活依赖于一些列炎症蛋白酶（Caspase）复合体的募集，蛋白酶1（Caspase-1）在其中起关键作用，而Caspase-1的激活主要依赖于免疫系统相关因子的诱导［16］。Caspase-1激活诱导NALP3产生，NALP3进一步激活IL-1β和IL-18，从而启动 MSU激发的滑膜炎症反应，形成痛风发作的急性炎症状态［17］。而本研究结果示火针疗法可有效抑制模型大鼠NALP3的活化及IL-1分泌的作用，其效果与针刺及秋水仙碱相当。秋水仙碱是目前治疗痛风性关节炎的一线药物［18］，但易引起毒副作用，不能长期应用，故火针疗法可作为急性痛风性关节炎治疗的有效方法，可减少秋水仙碱的用量或缩短疗程，从而减轻服药物引起的毒副作用。与普通针刺组比较，火针疗法与其疗效相当，但通过对大鼠关节组织病理形态学的观察发现，其对关节的病理损害较针刺组轻，故可见火针疗法是治疗急性痛风性关节炎的有效优选方法。

［1］ 李娜，华龙，袁慧.痛风动物模型的研究进展［J］.医学理论与实践，2016，29（24）： 3335-3337.

［2］ 李丹，张剑勇.痛风现代流行病学及降尿酸药物研究进展［J］.风湿病与关节炎，2016，5（4）：73-76.

［3］ 李高兴.痛风治疗经验谈［J］.现代中医药，2017，37（4）：5-7.

［4］ 王璐，那莎，陈光亮.萆薢总皂苷对大鼠急性痛风性关节炎NALP3炎性体信号通路的影响［J］.中国药理学通报，2017，33（3）：354-360.

［5］ Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis （AJUA） in rats：an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund′s adjuvant［J］.Pain，1987，28（3）：379-393.

［6］ Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and antiarthritic agents［J］.Pharmacol Biochem Behav，1988，29（3）：461-466.

［7］ 余曙光，徐斌.实验针灸学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2012：270-271.

［8］ Mankin HJ，Dorfman H，Lippiello L，et al.Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips.II.Correlation of morphology with biochemical and metabolic data［J］.Journal of Bone&Joint Surgery American Volume，1971，53（3）：523-537.

［9］ 罗恒，徐红.徐红主任医师治疗痛风经验［J］.陕西中医药大学学报，2016，39（2）：21-22.

［10］彭意.火针“火郁发之”法治疗带状疱疹急性期镇痛时效的临床研究［D］.广州：广州中医药大学，2013.

［11］董方.火针“火郁发之”法治疗急性期带状疱疹临床疗效研究［D］.广州：广州中医药大学，2013.

［12］崔炎，王平，张榜，等.急性痛风性关节炎与血尿酸及尿酸盐结晶的关系［J］.中国中西医结合外科杂志，2014，20（5）：501-503.

［13］曹建梅，王晓霞，郭景煜，等.IL-1β在痛风性关节炎中的致炎作用及临床意义［J］.中华临床医师杂志：电子版，2016，10（5）：728-731.

［14］张瑞芬，赵晶.痛风发病机制研究进展［J］.实用药物与临床，2007，10（4）：244-246.

［15］Martinon F，Burns K，Tschopp J.The inflammasome：a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta［J］.Mol Cell，2002，（10）：417-426.

［16］Keller M，Ruegg A，Werner S，et al.Active caspase-1 is a regulator of unconventional protein secretion［J］.Cell，2008，132（5）：818-831.

［17］ Fabio Martinon1，Virginie Petrillil，Annick Mayor1，et al.Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome［J］.NATURE，2006，440（9）：237-211.

［18］吴华香.2012年美国风湿病学会痛风治疗指南解读［J］.现代实用医学，2013，25（8）：843-846.