肺损伤的干细胞治疗

张琦，帅训军，侯念果，艾登斌*

（1泰山医学院研究生处，泰安，271000；2山东省青岛市市立医院麻醉科，山东省青岛市临床麻醉研究中心，青岛，266000）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）（ALI/ARDS）起病之初由肺局部或远隔组织损伤引起，临床屡见继发于严重的反应性肺炎、败血症、有毒剂吸入、急性胰腺炎、多发性创伤及大量输血等。ALI/ARDS患者肺组织局部炎性介质（如炎性因子、趋化因子、蛋白酶、活性氧物质、细胞凋亡激活剂和抑制剂激活的活性氧自由基）的释放，肺部充斥促炎性细胞因子及嗜中性粒细胞。促炎性细胞因子囊括有：趋化因子配体-1（chemokine ligands-1，CXCL-1）、趋化因子配体-2（chemokine ligands-2, CXCL-2）、白细胞介素-6（interleukin , IL-6）、干扰素，白细胞介素-6和细胞间黏附分子-1和肿瘤坏死因子 -α（tumor necrosis factor, TNF-α）[1]；嗜中性粒细胞依赖性组织损伤是ALI/ARDS的主要病因：嗜中性粒细胞聚积于肺组织将机械性阻塞肺毛细血管床，终至微循环障碍。再者，其代谢产生过量活性氧物质（reactive oxygen species, ROS）和含氮物质如氧自由基、NO等，通过它们的氧化剂系统生成吞噬细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，进一步产生氧化酶和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS），摧毁肺泡毛细血管屏障、提高渗透性，结果导致富含蛋白质的液体渗入肺泡腔和间质组织，引发非心源性肺水肿。截至目前，研究表明ALI/ARDS小鼠肺中髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性增加，MPO酶是检验嗜中性粒细胞的渗透活动能力的金标准。以上综合作用，最终引起肺组织病理生理学改变内容包括：弥漫性肺泡上皮损伤、肺泡 - 毛细血管膜分解、失去完整性、肺泡毛细血管通透性增加，鉴于以上因素的协同作用，结果蛋白质流体不可逆性渗入肺泡。

ALI / ARDS患者多表现有：急性发作性呼吸急促、高热、心动过速和呼吸困难，疾病不可逆性的进展至极端情况下，出现难治性呼吸衰竭、多器官功能衰竭及并发其他基础疾病。目前的治疗方案仅局限于基础医疗护理和支持性通气策略[2]等对症治疗，尚无法逆转疾病进程、提高患者生活质量及降低病死率。经动物实验研究发现，人脐带MSC（human umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）的道德问题很少、治疗效果确切可靠，进而给广大临床治疗及实验研究工作者带来新的曙光，目前正致力于评估其潜在的临床应用价值：外周移植干细胞，其主动、趋化性定植于动物受损局部组织，主动分化出成熟组织细胞以弥补、修缮损伤组织结构；分泌促生长因子以促进受损细胞修复再生；分泌抗炎因子从而抑制细胞炎症反应；分泌抗菌性细胞微生物肽成分直接在肺组织的局部发挥杀灭细菌作用；除此之外，干细胞还释放参与调节适应性、先天性免疫的细胞因子、调节肺内皮和上皮细胞等细胞膜通透性的细胞因子。至此，我们对于干细胞治疗肺损伤的具体作用机制知之甚少，鉴于研究人员不懈努力的付出，干细胞治疗肺损伤的课题引起国内外学者的高度重视，由此成为业界学者重点研究的方向。

1 间充质干细胞治疗肺损伤

治疗ALI/ARDS核心步骤是要实现肺结构重建、功能修复以及恢复正常的气体交换。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为骨髓动员细胞中最丰富的储存细胞，在肺部具有协助受伤组织的修复和引导细胞新生、与此同时激活肺组织自我修复的潜力、改善肺组织局部微循环进而重建肺泡气体交换[3]。干细胞免疫原性极低，规避了道德争议；其来源广泛、提取及制备方法简单[4],研究已证实经静脉、咽及气管内接种干细胞，减轻LPS、博来霉素、肺部撞击以及高氧等诱导的鼠ALI/ARDS[5,6]，注射MSCs后鼠肺胶原沉积和纤维化程度明显减轻[7]，接着检测抗炎性细胞因子得出∶白介素-10（interleukin-10，IL-10）的表达水平急剧增加。MSCs是由多能干细胞所衍生的、能够持续自我更新的原始细胞，其具有前瞻性的修复ALI/ARDS鼠肺损伤细胞，在受损局部刺激组织再生，研究结果揭示其降低促纤维化因子表达水平，如转化生长因子 -α（transforming growth factor-α, TGF-α）、I-型胶原（ collagen-I, Col-I）和III型胶原纤维（ collagen-III, Col-III）表达明显下降，结果抑制了肺部纤维化进展。

研究表明骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）对ALI/ARDS的保护作用主要涉及以下几个方面：外周输注BMSCs后，其将主动性归巢至受损伤的肺组织[8]，减轻局部炎症性损伤[9-10]，促进内皮细胞修复及恢复免疫功能不协调[11]，移植肺中的MSCs具有自我更新和分化为间充质细胞的能力。众所周知，标准的MSCs具有成骨、脂肪生成和软骨成骨的体外能力[12]，其发挥治疗ALI/ARDS的作用机制包括：线粒体之间的DNA的传输和其他胞质成份通过细胞间桥梁，可以调节受体细胞的细胞生物学功能[13]，干细胞通过外分泌IL-10、IL-RN、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF）、血管生成素-1（angiogenin-1）作为ALI/ARDS中气体-血管屏障上的抗炎和预处理介质[14-16]。干细胞分泌微囊泡（microvesicle，MV），包含具有治疗作用及修复损伤的潜力的mRNA和miRNA[17-19]。BMSCs保护大肠杆菌诱导的鼠ALI/ARDS、削弱全身性氧化应激反应[20]，在体外ALI/ARDS模型中，BMSCs恢复钠离子输送、保存肺泡上皮通透性进而帮助重建肺上皮结构[21]，减轻炎症、提升细菌性肺炎中的细菌清除率[22]。

2 间充质干细胞修复肺损伤时受神经内分泌免疫网络的影响

ALI/ARDS的病因影响MSCs的修复效率和再生方式，前人关于鼠ALI/ARDS的干细胞治疗的研究揭示了时间肺重建效率、功能修复过程快慢取决于制模时的诱导因素如活细菌、油酸、荧光素、病毒及真菌等[23]，其次神经内分泌免疫网络的一致性原则对修复损伤肺产生的影响表现为：受伤的肺部释放大量与压力有关的神经内分泌激素、神经调节因子和神经肽，对MSCs的生物活性产生深远影响[24-26]，越来越多的证据表明糖皮质激素、肾上腺素和去甲肾上腺素可能参与MSCs动员期间的细胞迁移和活化过程[27]。MSCs再生和修复肺的机制很复杂，我们在强调受体神经内分泌免疫网络微环境调控MSCs作用的同时，患者免疫状态的保护功效也与MSCs减轻小鼠的肺损伤有关，由此可见，神经内分泌的协调免疫网络对肺修复和再生非常重要。外源性MSCs修复肺损伤及再生肺细胞的优势作用与鼠被接种多细胞数量成正相关[28]。在使用MSCs治疗ALI/ARDS的过程中不可避免的要仔细考虑其潜在的污染性、生物安全性等问题带来的隐患。一旦细胞接种完成后，这些MSCs在受体内周转率也进一步提高，仍需注意控制降低移植相关免疫排斥反应和畸胎瘤形成的风险[29-31]。

3 间充质干细胞的年龄及来源对其修复能力的影响

MSCs衍生的MV在组织细胞分化中发挥重要抑制作用，其激活、调节性产生新的T细胞及在体外促进干扰素-γ（IFN-γ）释放，刺激分泌抗炎性细胞因子（白介素（IL）-10和转化生长因子（TGF-α），表明MSCs衍生的MV是治疗相关的免疫调节试剂。外源性MSCs的突出优势即在于其相对高安全性、可及性，只需要合理使用激活原件即可实施MSCs在骨髓、血液和肺中的动员以及再分配。另外，还有其他针对MSCs的重要发现及相应研究报道，有学者称发现一些从骨髓、胎盘和脐带血提取的、具有免疫性能的MSCs与受着体内T细胞产生差异性对抗。由此可见，影响免疫排斥反应强弱的因素，首先需考虑MSCs供体年龄和受体接种方式；其次同一物种之间接种MSCs的治疗效果优于不同物种，而相同物种之间接种MSCs，自体移植治疗效果优于异体移植[32,33]；老化的MSCs显示出低下的迁移能力，易被受体免疫性T细胞杀伤，因此得出患者自体幼稚的MSCs是实现精准治疗的首选[34]。

4 间充质干细胞的接种途径对其修复能力的影响及“人造肺”模型

接种MSCs的途径也影响MSCs发挥治疗作用的功效，合理地移植接种途径如静脉、气管、胸膜内以及腹膜内等为较理想的接种途径。通过腹膜内给于鼠MSCs治疗胺碘酮诱导的鼠ALI/ARDS中，其治疗效果远远落后于静脉内接种途径[35]。众多临床工作者对受伤的肺组织修复的研究进行到目前为止，几乎没有发现健康供体肺用于移植。鉴于此事实，最近有学者们提出生物“人造肺”模型。业内学者们致力于寻找接种MSCs的高效途径的同时，研究运用胎肺细胞培育出成熟肺结构，以构建可以完全取代受损肺组织的生物“人造肺”。但由于生物肺复杂的三维组织结构和40多种细胞类型，结果限制了实验人员完美的构建出生物肺模型。虽然生物“人造肺”具有重要的研究利用价值，可能为严重ALI/ARDS患者提供替代治疗措施，并将使阳光照射全球5000万终末期ALI/ARDS患者，但不可规避的困难在于涉及其基质的完整性的问题如气体交换能力有限等还有待解决。

肺的内源性重塑、修复和再生已经成为难治性肺部疾病的重点治疗途径，大多数成功的ALI/ARDS治疗实验，使用的是啮齿动物模型来完成[36]。动物肺在胸腔内增加个体生命周期的能力与人类是完全不同的，内源性、外源性MSCs移植到成熟的人类肺组织中必然要克服免疫排斥反应带来的困难；其次，目前实验研究重点仅在于低排斥性的人角膜上皮细胞（ human corneal epithelial stem cell，HCEC），其他类型干细胞治疗作用的研究技术尚不成熟、干细胞研究领域仍有全新领域待开发。研究数据表明，通过KGF、HGF和类视色素酸等调节剂可以安全有效的实现MSCs的自我更新、增殖、迁移和分化，有学者提出内源性及外源性MSCs组合治疗，利用互补治疗作用，可能提高ALI/ARDS临床疗效[37,38]。

5 肺泡II型上皮细胞治疗肺损伤的机制

诱导多能干细胞（pluripotent stem cells, iPSC）分化出来的肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells,AECs）代表了肺组织工程和细胞疗法为肺损伤研究者提供了新机会。在前人研究中，通过修改胚胎干细胞的培养方案，获得了表面活性蛋白C（surfactant protein C, SPC）以及肺泡上皮II型细胞（alveolar type II epithelial cells，AEC II）。分化后的iPSC显示出与AEC II细胞相似的形态学特征。当分化的iPSC接种并在去细胞化的小鼠肺支架中培养时，细胞重新形成肺泡结构并表达SPC或T1α蛋白（分别为AEC II或AEC I细胞的标记）。分化的iPSC经气管滴入博来霉素诱导的小鼠急性肺损伤模型。分化后的iPSC移植后可以观察到显着减少的鼠肺部炎症和胶原沉积的降低。分化的iPSC显示出再生三维肺泡肺结构的潜力，并可用于消除肺损伤。

6 肺损伤治疗的局限及未来希望

目前针对肺损伤的治疗药物，仅仅只能稳定患者病情或延缓疾病进展，无法从根源上恢复受损的肺功能。虽然肺移植是这些肺疾病进展至晚期的唯一明确选择，但供体器官短缺是一个主要问题。组织工程以及再生医学是用于交换受损细胞或组织与新功能细胞或组织的新的多学科领域。终末期肺病的再生医学的最关键一步是：诱导干细胞生成包含两种细胞类型的肺泡上皮细胞即肺泡上皮I型和II型细胞（AEC I和AEC II）。 AEC II细胞在肺损伤的前提下已经显示出经历增殖和分化为AEC I细胞以修复损伤的肺泡上皮的功能，但这种修复过程通常导致肺结构的不适当重建。多能细胞中的胚胎干细胞（ESCs）具有自我更新能力，可在体外分化成肺泡上皮细胞，但免疫排斥和伦理问题限制了胚胎干细胞的临床应用。通过引入几种确定的、从分化的体细胞中获得的转录因子诱导iPSCs，其表现出与ESC相似的自我更新特性和多能性。另外，它们有可能克服上述ESCs的限制性问题。这些细胞可以在三维培养物中使脱细胞的小鼠肺支架再细胞化。这些分化的细胞植入鼠肺后改善了肺损伤。

尽管如此，我们对未来的展望和最后的发展方向仍抱有强烈的信心：干细胞疗法为修复严重的急性和慢性肺损伤拓宽了研究空间和领域。尽管一些研究已经证明了骨髓干细胞在啮齿动物肺损伤模型中的治疗潜力，但没有直接临床证据表明这些干细胞在人体内能填充肺泡上皮细胞。广大学者在看到曙光的同时，需要投入更多精力钻研。