心力衰竭中心肌细胞线粒体融合与分裂

赵强，刘芬，杨毅宁

（新疆医科大学第一附属医院心脏中心，新疆乌鲁木齐，830054）

心力衰竭（heart failure，HF）是一组由结构性心脏病和（或）心脏本身功能异常引起心输出量降低和/或心腔内压力升高的临床综合征，为各种心血管疾病的终末期表现，在世界范围内普遍高发。流行病学调查显示，发达国家HF患病率约为1%-2%，70岁以上人群中这一比例更是高达10%以上[1,2]。《中国心血管病报告2016》指出，我国HF患病率约为1%，目前约有450万人罹患该疾病[3]。HF高患病率、高死亡率及高再住院率已对人类健康及公共卫生服务系统造成重大威胁。目前较为公认的HF发病机制主要包括神经体液系统过度激活、免疫调节紊乱、能量代谢障碍、氧化应激损伤等，其中，能量代谢和氧化应激损伤机制均以线粒体为核心展开，可见线粒体在HF中的核心地位。

心脏是人体中能量需求和消耗最多的器官，但心肌细胞内ATP浓度却很低，这就意味着心肌细胞必须不断地合成ATP以维持正常的舒缩功能。线粒体是细胞内氧化磷酸化、合成ATP的最主要场所，心肌细胞中含有大量线粒体。心肌细胞线粒体形态和功能对于维持正常的心脏结构和功能至关重要，在心肌缺血、肥大、衰老和HF等多种心血管病理过程中均观察到不同程度的线粒体损伤[4-7]。随着显微技术和报告荧光标记手段的进步，人们逐渐认识到线粒体并非是静态、结构恒定、孤立的细胞器，而是通过不断地融合与分裂进行迁移、相互连接以及自我更新以适应细胞状态的变化，该过程即为线粒体动力学（mitochondrial dynamics）[8,9]。近年来，线粒体融合与分裂过程在HF发病中的研究陆续展开，本文对相关进展作简要综述。

1 线粒体融合与分裂的生理学作用

Davies和Ishihara相继报道，敲除线粒体融合、分裂蛋白编码基因会导致小鼠胚胎致死现象[10-12]，提示线粒体融合与分裂在维持机体生命活动中发挥必不可缺的生理学功能。总体来说，线粒体通过相互融合的方式对受损线粒体进行修复，而自我分裂有利于清除不可修复的受损线粒体[13]。

线粒体融合包括：①动力蛋白超家族鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatases，GTPase）的重要成员线粒体融合蛋白（mitofusion，Mfn）以GTP非依赖的形式将毗邻的两个线粒体外膜相互拉近，②Mfn以 GTP依赖的形式介导外膜融合，③视神经萎缩症蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）介导内膜融合[14]。线粒体融合使线粒体与线粒体之间的相互联系更为紧密，促进线粒体内代谢产物以及线粒体DNA通过网状结构进行交换，有利于维持线粒体膜电位、修复线粒体DNA，并且具有促使线粒体间蛋白质组分互补的实际意义[13,15]。通过融合，线粒体能够在细胞能量不足时使其氧化磷酸化能力最大化，满足细胞能量需求。相反，当融合过程受阻时，线粒体膜电位、细胞氧耗以及线粒体DNA水平均降低。如果线粒体过度融合或者分裂缺乏时，线粒体将会聚集在细胞的局部，引起其他部位没有线粒体，或者两个受损线粒体进行融合，均会影响线粒体功能[13,16]。此外，融合能够使线粒体免受线粒体自噬等形式的清除，在心肌细胞中，显性抑制Drp1或者Mfn1能够防止线粒体过度分裂以及自噬[17,18]。

线粒体分裂的过程比融合更加直截了当，分为“结扎”和“分离”两步，有学者形象地将其比喻成“香肠制作过程”。线粒体分裂主要是GTPase家族成员动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）作用的结果。Drp1募集至线粒体外膜后，线粒体以GTP依赖的形式进行收缩，最终将一个线粒体分离成为两个子线粒体（daughter mitochondria）。为完成上述过程，线粒体内可能存在一系列预处理反应，但是具体分子机制还不清楚。线粒体分裂将不可修复的线粒体进行碎片化处理、清除出细胞，以保持线粒体的质量，保护线粒体网络的正常功能。分裂出来的子线粒体如果保有正常膜电位，就能够与其他线粒体进行融合，继续代谢产能；否则，将通过自噬的形式被清除出细胞。线粒体分裂对于线粒体DNA的重分配以及细胞有丝分裂中如何将线粒体运输至子代细胞等过程也十分必要。研究者发现，在细胞进行有丝分裂的过程中，线粒体形态和数量均在不停地变化，尤其是在分裂中期能够观察到明显的线粒体分裂现象，这对于细胞遗传物质传递非常关键。一旦线粒体分裂调控的机制失控或被破坏，线粒体分裂就会通过促进细胞凋亡、改变能量代谢稳态等方式参与病理过程。

2 线粒体融合与分裂调控的分子机制

部分研究者认为，由于内部结构独具复杂性，心肌细胞（尤其是成年心肌细胞）内线粒体融合与分裂活动十分有限。然而，实验数据表明心脏中线粒体动力蛋白家族各个分子表达水平均很高，提示心肌中的这些蛋白可能通过更为独特和高效的方式进行线粒体调控。

2.1 线粒体融合相关调控蛋白

线粒体外膜和内膜融合是相对独立的过程，由不同分子进行调控，其中Mfn1和Mfn2介导外膜融合，而OPA1介导内膜融合。Mfn与OPA1在结构和作用方式具有高度相似性。Mfn1和Mfn2定位于线粒体外膜，二者都具有N末端的GTPase结构域、C末端的疏水coiled-coil结构域（HR1和HR2）以及疏水跨膜结构域。Mfn的GTPase结构域决定着它会以GTP依赖的方式参与线粒体融合，coiled-coil结构域有利于与其他蛋白产生相互作用，而跨膜结构域有助于锚定在线粒体外膜上。Mfn位于胞质中的非跨膜部分与另一Mfn分子的coiled-coil结构域相互作用，使两个毗邻线粒体外膜彼此靠近，形成一个连接，意味着融合开始。尽管Mfn1和Mfn2在结构上约有77%相似性，但它们对心肌细胞线粒体融合的调节效应差异却很大[13]。特异性敲除心肌Mfn1基因后，心肌细胞线粒体呈碎片化[19]；而敲除Mfn2基因后，心肌细胞线粒体则延长[20]。与Mfn2相比，Mfn1的GTPase酶活性更高，具有更强的GTP依赖形式拉近两个线粒体的能力[21]；同时，抑制Mfn1比抑制Mfn2会产生更多的碎片化线粒体，由此推断Mfn1可能在外膜融合中的作用更为重要[22]。此外，Mfn2还存在于内质网/肌质网，参与代谢调节以及病理性内质网应激过程。

线粒体外膜融合后，由OPA1介导线粒体内膜进行融合。在细胞水平敲除Opa1基因虽然不会影响线粒体彼此靠近以及外膜融合的过程，但是会影响线粒体内膜融合以及线粒体嵴的形态，引起线粒体膜电位坍塌、呼吸功能受损以及细胞色素C外漏[23]。与正常小鼠相比，Opa1+/-小鼠LVEF（Left ventricular ejection fraction，左室射血分数）值更低，一年期HF发生率更高[24]。然而，过度表达OPA1也使心肌细胞线粒体呈现过度碎片化，产生细胞毒性[25]，提示OPA1对线粒体融合调控是在一定范围内进行的。另外，在缺少Mfn1存在的情况下，OPA1并不能促进线粒体融合，说明内膜和外膜融合过程间还存在一定联系[25]。哺乳动物体内，OPA1主要以长OPA1（long OPA1 protein structure，L-OPA1）和短OPA1（short OPA1 protein structure，S-OPA1）两种形式存在。在肠肽酶OMA1和i-AAA蛋白水解酶YME1L作用下， L-OPA1可被水解成S-OPA1，前者锚定于线粒体内膜上调节内膜融合，而后者位于膜间隙，促进线粒体片段化及分裂[26]。OMA1和YME1L含量的平衡对于OPA1调节线粒体融合的作用至关重要，特异性敲除心肌组织中Yme1l基因后能够使OMA1活性增强，最终导致扩张型心肌病以及HF[27]。

2.2 线粒体分裂相关调控蛋白

哺乳动物体内调控线粒体外膜分裂蛋白包括Drp1、线粒体分裂蛋白1（mitochondrial fission 1，Fis1）、线粒体分裂因子（mitochondrial fission factor，Mff）、MiD49及MiD51等，内膜分裂调控蛋白有S-OPA1和线粒体蛋白18（mitochondrial protein 18kDa，MTP18）等。

Drp1是调节线粒体分裂最主要的蛋白，具有氨基酸末端的GTPase结构域、C末端的GTPase作用结构域和中间域。正常情况下，绝大部分的Drp1位于细胞浆内，需要移位至线粒体外膜上才能够发挥调控分裂的作用。被募集到线粒体外膜的Drp1分子自我聚集后进行螺旋收缩，结扎和分离线粒体外膜和内膜[28,29]。在正常或者应激状态下，下调Drp1水平均导致心肌细胞内去极化线粒体数量增加。在心肌缺血损伤模型中，PKA磷酸化Drp1 Ser637位点能够抑制胞质内Drp1向线粒体外膜转位并且抑制其GTPase活性，减轻线粒体过度分裂程度[30]。钙离子介导的Drp1 Ser637去磷酸化，则会使Drp1向线粒体外膜移位增多，促进线粒体分裂[31]。在心肌损伤再灌注阶段，Pim-1和PKCδ分别能够磷酸化Drp1的Ser637和Ser616位点，使其活化，其中Pim-1活化具有心肌细胞线粒体完整性及心肌保护作用，而PKCδ则恰恰相反[32,33]。

由于Drp1缺乏疏水跨膜结构域，必须与其他的受体蛋白绑定才能被募集到线粒体外膜[34]。Fis1是首个较为公认的线粒体受体蛋白，锚定于线粒体外膜。在酵母菌中，Fis1的N末端结构域能够与配体蛋白Mdv1、Caf4相结合并产生相互作用，促进Dnm1（即哺乳动物Drp1分子）-GTP寡聚体的合成与装配，参与调控线粒体分裂[35,36]。迄今为止，哺乳动物体内并未发现这些配体蛋白，因此Drp1与Fis1之间的具体作用方式还不清楚。研究表明，Fis1过表达确实能够诱导线粒体分裂，然而，部分细胞（如宫颈癌细胞和结肠癌细胞株）敲除Fis1基因并不会影响线粒体募集Drp1以及分裂的过程[37]。由此提示，Fis1并不是唯一参与线粒体招募Drp1过程的分子。Mff、MiD49、MiD51也锚定于线粒体外膜上，与Drp1移位关系密切。哺乳动物体内，Mff与Drp1共定位于线粒体上，敲减Mff后会阻碍Drp1向线粒体移位，使线粒体延长；而Mff过表达则会促进线粒体募集Drp1，导致线粒体分裂增加[37]。MiD49和MiD51能够以类似Drp1的作用方式在线粒体表面聚集、形成环状物对线粒体进行分割，也可以直接将Drp1招募至线粒体表面，敲低MiD49和MiD51会减弱Drp1的作用，促进线粒体融合[38]。

目前，Drp1介导的线粒体外膜收缩是否足以引起内膜分裂还不清楚，但S-OPA1和MTP18参与了线粒体内膜分裂的调控。如前所述，S-OPA1是OMA1和YME1L水解L-OPA1的产物，细胞缺乏SOPA1仍可出现线粒体融合，但是当S-OPA1异位表达并作用于线粒体内膜时，它会以不依赖于OMA1和YME1L水解的作用方式引起线粒体碎片化，提示S-OPA1集聚促使线粒体分裂的发生。S-OPA1还与线粒体外膜分裂处的细胞器元件共定位于线粒体-内质网/肌质网接触位点，共同参与线粒体分裂[26]。MTP18是18kDa大小的膜蛋白，大多数嵌于线粒体内膜，该分子敲减后会使线粒体呈现高度融合状态，异位表达则会导致线粒体分裂[39,40]。过表达MTP18与Drp1募集的关系也十分密切，但分子机制有待进一步探索[39]。

3 线粒体融合与HF

特异性敲除小鼠心脏Mfn1和Mfn2基因，会引起心肌线粒体过度分裂以及呼吸链功能异常，最终迅速发展成为致死性的扩张型心肌病，提示Mfn基因缺陷引起的线粒体融合过程受阻在HF发展中具有重要意义[41]。众所周知，细胞凋亡引起的心肌细胞慢性流失是HF发病的重要因素。Mfn1基因缺陷会引起大鼠原代心肌细胞线粒体过度分裂，细胞凋亡增加，其过表达后则会逆转心肌凋亡[42]。然而，Mfn1和Mfn2在人缺血性心肌病及扩张型心肌病所致HF的心肌组织中表达均升高[43]。Papanicolaou也发现，尽管Mfn1-/-心肌细胞中过度分裂的线粒体显著增多，但却能够改善ROS所致线粒体功能障碍以及细胞死亡[44]。这些矛盾的结果仍需进一步探究。

Mfn2在心肌细胞氧化应激损伤、缺血再灌注损伤模型中均显著升高。过表达Mfn2可能通过抑制Akt信号通路引起心肌细胞凋亡增加，而沉默Mfn2后会减少氧化应激所致心肌细胞凋亡[45]。Mfn2低表达能够引起心肌细胞线粒体变大，增加细胞对钙离子所致MPTP开放以及ROS损伤的耐受性，这可能是敲除Mfn2抗心肌细胞凋亡的机制之一[46]。由于Mfn2也分布于内质网上，它可以调控内质网内的钙离子流向临近线粒体，敲除心肌Mfn2基因会破坏线粒体与内质网的联系以及钙离子稳态[46,47]，这可能是Mfn2促心肌细胞凋亡的另一种重要机制。此外，部分研究则表明Mfn2具有抗心肌细胞凋亡的双重作用。Chen报道Mfn2-/-心肌细胞会出现线粒体膜电位塌陷以及ROS水平增加的现象[47]。Parra在神经酰胺诱导大鼠原代心肌细胞凋亡的模型也发现，Mfn2表达下调会减小线粒体体积、增加其碎片化，加剧细胞色素C外流，增加早期凋亡。

Dorn研究发现，沉默果蝇体内MARF（果蝇体内调控线粒体外膜融合的唯一蛋白）和OPA1表达后会引起线粒体形态不一、平均体积减小，最终导致心管扩张以及严重收缩功能障碍；在其体内过表达人Mfn1或者Mfn2后则能够改善心肌病进展。上述结果不仅说明线粒体融合过程在心肌病进展具有重要作用，也提示Mfn与OPA1在线粒体融合调控方面存在一定的交互作用[48]。人缺血性心肌病以及大鼠心肌梗死后HF的心肌组织均发现OPA1表达水平显著降低，在透射电镜下观察到心肌细胞线粒体呈碎小、片段化状态[43]。杂合型Opa1+/-小鼠心肌中亦出现线粒体功能障碍、线粒体DNA不稳定以及ROS水平增加等改变，并最终进展成为心肌病[24,49]。然而，人扩张型心肌病所致衰竭心肌中OPA1却无明显变化[43]。此外，缺血刺激使H9C2心肌细胞系中OPA1水平降低，伴线粒体过度分裂[50]；而过表达该蛋白虽然能够促进H9C2心肌细胞线粒体融合，但并不能减少缺血所致的心肌细胞死亡[43]。据此，进一步证实OPA1对心肌组织具有两面性：适当增加OPA1表达能够促进线粒体融合发挥心肌保护作用，过度表达则引起相反的心肌损害效应。

4 线粒体分裂与HF

研究表明，Drp1能够促进线粒体外膜透化作用以及细胞色素C释放，而抑制该蛋白的表达、维持线粒体形态稳定后则能够逆转上述心肌损害作用，可能是Drp1参与HF发病的重要分子机制。Ikeda报道，特异性敲除心脏Drp1基因会使小鼠心肌线粒体自噬减少、功能障碍的线粒体数目增多，逐渐出现左心室功能障碍[51]。无论在心肌细胞系还是成年心肌细胞，Drp1的抑制剂Mdivi-1均能够改善线粒体膜电位降低、过度分裂，减少细胞凋亡[52,53]。总体来说，Mdivi-1抑制Drp1介导线粒体分裂能够减少缺血再灌注损伤的心肌梗死面积，具有一定的心血管保护作用[53]。钙调神经磷酸酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶，在梗死、衰竭心肌中显著增高。Wang研究发现，心脏中存在调控心肌细胞凋亡的miR499/钙调神经磷酸酶/Drp1轴，简言之，miR499抑制钙调神经磷酸酶介导的Drp1去磷酸化过程，进而减少Drp1向线粒体外膜移位及由此引起的线粒体分裂、细胞凋亡，最终改善心肌梗死损伤及心功能[54]。泛素化修饰是Drp1发挥功能的重要方式之一，SENP5为Drp1去泛素化过程所必需的酶，该酶在原发性心肌病引起的衰竭心肌中显著增加。在小鼠体内，SENP5过表达使Drp1去泛素化水平增加、Drp1含量增多，引起线粒体功能障碍以及心肌病，进一步证实了Drp1在HF发展中的作用[55]。

哺乳动物细胞中，减少Fis1、Mff和MTP18等线粒体分裂蛋白表达后，能够相应地抑制细胞色素C释放及随之而来的细胞凋亡。结扎大鼠冠状动脉12和18周后，心肌Fis1水平较对照组分别增加80%和31%[56]，气体信号分子H2S可能正是通过抑制Drp1和Fis1、增加融合相关蛋白等，改善了线粒体形态及功能，发挥对心肌肥厚的保护作用[57]。Chen研究发现，Mff基因缺陷使小鼠心肌组织内线粒体密度降低、呼吸链功能损害以及线粒体自噬水平增加，引起严重扩张型心肌病并逐渐发展为HF，最终导致小鼠发病13周时死亡。[58]。Wang最新报道，siRNA沉默MTP18表达后会抑制心肌细胞线粒体分裂，减少细胞凋亡，减轻心肌缺血损伤，具有一定的心肌保护效应[59]。

5 结语与展望

细胞和整体水平展开的研究结果均证实，线粒体融合、分裂异常以及相关调控蛋白变化所致线粒体形态和功能改变是HF发生和发展的重要机制之一。正是由于线粒体融合与分裂过程及调控蛋白的关键作用，在动物模型水平已有一些针对相关调控分子的化合物用于试验性的治疗。例如，短期应用Drp1抑制剂Mdivi-1能够减轻心肌缺血再灌注损伤发挥心肌保护作用。然而，我们也要客观地认识到长期应用Mdivi-1治疗心肌肥厚或糖尿病心肌肥大则可能使细胞内受损线粒体蓄积增多，损害心功能[60]，说明我们以此为思路开发和应用于HF治疗的新药仍需要进一步探索。目前，我们对线粒体动力学调控的具体过程及机制认识还十分有限，尤其是线粒体分裂调控过程及其与线粒体自噬的联系，在这一领域进行深入研究有利于揭示HF发病规律，也有助于HF的防治和临床预后改善。需要特别强调的是，在预防或改善HF进展的尝试中维持线粒体融合与分裂的平衡比单独改变某一独立过程更为重要。