生物工程

常压室温等离子体快速诱变产油酵母的条件及其突变株的特性

金丽华，方明月，张翀，等

摘要：目的：利用微生物转化生物质生产生物柴油是发展可再生清洁能源的重要途径之一。但微生物合成油脂存在培养过程复杂、产油效率有限、菌种耐受性差等问题，限制微生物生产油脂技术的产业化发展。本论文采用了课题组自主发明的常压室温等离子体（ARTP）方法构建产油圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）突变库，设计高通量筛选方法筛选高产油脂的突变株，并表征其发酵性能。方法：（1）诱变：采用了常压室温等离子体（ARTP）照射2分钟菌液的方法诱变产油圆红冬孢酵母，将照射处理后的产油酵母稀释，并涂板培养出突变株的单菌落。（2）高通量筛选：为了快速筛选增殖速度快且产油量多的突变体，采用了基于尼罗红染色的多孔板的高通量筛选方法。48孔板适合培养1 mL菌液，而且在培养过程中可以连续直接检测细胞吸光度，或者是结合96孔板检测其吸光度和相对油脂量。这一操作流程简便可行，实现了突变株的快速筛选。结果：（1）ARTP照射对圆红冬孢酵母的致死效果比较明显，ARTP处理10 s、1 min和4 min后细胞致死率分别达到80%、90%和100%。本实验为了便于选择单菌落突变株，选取ARTP处理2 min（致死率为99%）进行诱变处理。（2）ARTP诱变后获得菌落培养48 h后，有12株诱变菌的增殖速度提高到原始菌的1.2倍以上（最高达到2.3倍）；以相对增殖速度为指标计算出的产油酵母的总突变率为47.2%，其中正突变率达到27.2%。通过多孔板的高通量筛选方法获得了 6株增殖速度和油脂产量都比原始菌株提高了20%以上的突变株（C4，D4，F4，A7，A8和E8）。（3）对筛选出的上述六株突变株进行了六代的传代培养后，对其油脂含量分析结果表明，ARTP诱变育种得到的突变体都具有良好的遗传稳定性。（4）上述 6株突变株的增殖速度及油脂量均是原始菌株的1.2倍以上。为了表征突变株的培养特性和油脂发酵过程，本文进行了摇瓶发酵培养。结果表明，在未优化的含20 g/L葡萄糖YEPD培养基中摇瓶发酵78 h后，原始菌的细胞干重为8.4 g/L，而增殖速度最快的突变株C4和E8的细胞干重达到了12.3 g/L；突变株C4的产油量达到了4.07 g/L，是原始菌株的2.2倍，表明突变株的产油效率得到了显著提高。结论：本研究表明，ARTP诱变育种方法能够快速有效地获得高产油脂圆红冬孢酵母突变株，且其遗传稳定性良好。以增殖速度为指标的总突变率为47.2%，其中正突变率达到27.2%。以增殖速度和油脂产量为指标，通过基于多孔板的高通量筛选方法，筛选得到一株高产油脂的突变株C4，其在YEPD培养基中培养78 h，产油量为原始菌的2.2倍，细胞浓度达到了原始菌株的1.5倍。本研究为高产油脂微生物的育种提供了高效方法。

来源出版物：生物工程学报, 2011, 27(3): 461-467

入选年份：2016

生物降解地膜应用与地膜残留污染防控

严昌荣，何文清，薛颖昊，等

摘要：目的：地膜是农业生产的重要物质资料之一，地膜覆盖技术应用带动了我国农业生产方式的重大改变和生产力的显著提高。2014年地膜用量到达了144万t，覆膜面积超过1800万hm2，使作物大面积增产20%～50%，对保障我国农产品安全做出了重大贡献。与此同时，由于大范围、长时间的地膜应用、超薄地膜的泛滥以及未能进行有效的回收，导致我国农田地膜残留污染问题日益严重，已成为一个重大环境问题。因此，本文针对我国地膜残留污染特征不清和生物降解地膜大规模应用制约因素不明确的问题开展研究。方法：基于文献调研方法和研究团队十多年有关地膜试验评价和残膜污染防控的研究积累，探明我国地膜覆盖现状、残膜污染特点、生物降解地膜应用趋势和生物降解地膜存在的问题和挑战，对我国生物降解地膜应用和残膜污染防控提出对策建议。结果：研究发现，地膜覆盖技术由于具有增加地温、保持土壤水分、抑制杂草、抑盐保苗、增加作物灌层中下部光照均匀程度和增加散射光等主要功能特点，成为提高农作物产量和改善农产品品质的关键。过去30多年来，地膜覆盖应用现状和发展趋势主要表现为：（1）地膜用量持续增加，覆膜面积进一步上升；（2）应用区域不断扩大，地膜使用强度逐年提高；（3）覆膜作物种类增加，技术模式日臻完善。地膜覆盖的规模应用对我国农业产生了巨大影响，使得我国农业生产方式和区域种植结构发生了革命性的变化，主要表现在：（1）改变作物播期，扩大了作物种植区域；（2）改变区域种植结构，构建了新型种植模式；（3）提高农作物产量，保障了国家粮食安全。残留地膜污染调查的结果表明，不同地区由于使用量、使用方式及覆膜年限的不同，土壤中残膜量也存在显著差异；绿洲农业区、黄土旱源区、东北风沙区、华北地区和西南山区等 5大区域长期覆膜农田土壤中地膜残留量为71.9～231.0 kg/hm2。地膜残留污染的危害表现在：（1）破坏土壤结构，降低了耕地地力水平；（2）影响土壤中水肥运移，降低了水肥有效性；（3）影响作物生长发育，降低农作物产量。近年来以淀粉基降解地膜、完全生物降解地膜和纤维素类生物降解地膜3类为代表的生物降解地膜研发取得长足发展。全国生物降解地膜试验评价发现，生物降解地膜目前存在的普遍性问题是机械强度不够，铺膜时容易断裂，机械化操作困难；降解的时间可控性差，破裂时间过早；增温保墒性能弱于普通PE地膜，尤其是作物生育前期最明显，对作物的生长发育和产量形成造成一定的影响。因此，生物降解地膜存在的问题和挑战是：（1）产品抗拉强度有待于进一步提高；（2）降解可控性与农作物需求存在差异；（3）增温保墒性能需要进一步加强；（4）降低产品成本，促进大规模应用。结论：生物降解地膜成为替代普通PE地膜，解决地膜残留污染的一种有效措施和手段，目前生物降解地膜正在处于产品研发和评价试验的关键阶段，部分生物降解地膜产品在马铃薯、花生、烟草生产上显示出良好的效果，但总体上还面临巨大挑战，主要包括需要进一步提高地膜产品质量，提高地膜产品破裂和降解可控性，改善地膜的增温保墒能力，实现满足农作物对地膜覆盖功能的要求；此外，需要降低生物降解地膜综合成本，促进生物降解地膜规模化应用，尤其是要研发针对特定区域和特定作物的专用生物降解地膜产品，以满足和适应农业生产多样性的要求。总体上，在技术进步和农业生产环境变化的条件下，生物降解地膜应用将具有良好的前景。

来源出版物：生物工程学报, 2016, 32(6): 748-760

入选年份：2016

泛素、泛素链和蛋白质泛素化研究进展

兰秋艳，高媛，李衍常，等

摘要：泛素化（ubiquitination）是一种广泛存在于真核生物的蛋白质翻译后修饰，参与并介导了蛋白质特异性降解、细胞周期调控、信号传导等多种生理过程，在维持细胞内环境稳态中发挥了重要的作用。泛素是一种由76个氨基酸组成的小蛋白，在酵母、线虫、果蝇、人类等几乎所有的真核生物中具有高度保守的蛋白序列和结构，其功能重要性可见一斑。在 E1（泛素激活酶）、E2（泛素耦联酶）和E3（泛素连接酶）的级联酶促反应下，泛素分子共价连接到底物蛋白的赖氨酸残基上实现泛素化修饰。同时，泛素化作为一种可逆的翻译后修饰，受到多种去泛素化酶（DUB）的可逆性剪切，从而维持泛素化信号网络的动态平衡。泛素的起始甲硫氨酸和 7个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）可作为泛素继续修饰的位点，进而形成同质、异质或者分支泛素链。晶体结构研究显示，泛素分子采用一种由5个β折叠包裹一个α螺旋的SSHSSS结构，分子表面存在几个重要的疏水表面，介导了泛素与多个泛素结合结构域的识别与结合。同时，不同的泛素链亦可形成不同的空间构象，在不同级联反应酶的作用下，修饰多种底物蛋白的不同赖氨酸位点，参与到各异但可能存在部分互补性的信号传递反应中，从而构成了生物体内底物泛素化修饰的宏观与微观不均一性。这为机体复杂信号网络以及有序的时空规律的调控维持提供了简洁但多样的物质基础。研究显示，泛素化修饰参与基因复制与转录、蛋白质翻译、信号转导、细胞周期、生长发育以及对外源刺激的应激等几乎所有的生命活动过程，并在多种生理进程的发生发展中起到了至关重要的作用。因此某些关键底物蛋白上任何泛素化修饰的异常都可能引发内环境稳态的失衡，进而诱发一系列应答信号，最终造成严重的病理效应。探索机体各生理过程中泛素化修饰的调控机制，对于理清重大疾病信号调控网络，寻找关键调控靶点及其特异性药物也具有重要的意义。然而，泛素化信号的低丰度、不稳定性、瞬时效应以及复杂性给泛素化信号网络的搭建带来了巨大的挑战。近年来，随着生命科学技术的迅猛发展，高覆盖定量蛋白质组学、多种亲和富集策略以及生物信息学等多种研究策略的广泛应用给这一领域的发展带来了契机。相信在不远的将来，人们将有能力将这一领域的研究带入全新的局面。

来源出版物：生物工程学报, 2016, 32(1): 14-30

入选年份：2016

血液制品的现状与展望

王卓，赵雄，吕茂民，等

摘要：目的：本文旨在对血浆蛋白制品和相应的重组制品研究现状进行综述，并对其未来发展趋势予以展望，以期为我国相关产品的研发提供借鉴和参考。方法：依据血浆蛋白的生理生化学，对其特性进行基础性介绍；根据血浆蛋白的临床应用效能，对其进行分门别类并对不同种类血浆蛋白的血源和重组血浆蛋白制品研发与应用进行综述分析；结合国内外血浆蛋白制品研发与应用现状，对其未来发展进行展望。结果：（1）血浆白蛋白制品最早应用于战伤救治的血液制品，高纯白蛋白提高了血清蛋白临床使用的安全性，注射级重组白蛋白可作为天然白蛋白的替代品用于临床，辅料级重组白蛋白可作为药物保护剂，重组白蛋白融合药物的研发和上市开创了血液制品的新局面。（2）免疫球蛋白作为传统的抗体治疗制剂经历了从动物源免疫球蛋白到人源免疫球蛋白，从肌肉注射免疫球蛋白到静脉注射免疫球蛋白，从正常免疫球蛋白到特异性免疫球蛋白的发展历程，其使用范围和适应症不断扩大。肌肉注射用免疫球蛋白因其制备工艺相对简单，使用方便，价格低廉且不良反应可以接受而一直在临床实践中应用；静脉注射用免疫球蛋白随着新的适应症不断发现，其应用范围越来越广；皮下注射用免疫球蛋白的出现使免疫球蛋白的使用更加方便，已经成为静脉注射用免疫球蛋白安全有效的替代品；针对特定病原体的特异性免疫球蛋白在临床上更具有不可替代的作用。（3）凝血因子和重组凝血因子类制品主要用于相应的先天性遗传性缺陷患者，纤维蛋白原、因子Ⅶ、因子Ⅷ、von Willebrand因子复合物、因子Ⅸ和凝血酶原复合物、因子Ⅺ、因子ⅩⅢ等制品在临床中的应用取得了良好的治疗效果。因子Ⅶa和活化凝血酶原复合物对于治疗产生凝血因子抑制物的血友病病人具有十分明显的效果。纤维蛋白原类制品和凝血酶在外科止血方面发挥着重要的作用。（4）随着分离技术的进步，血浆中的许多少量或微量蛋白成分被分离提纯。多种微量血浆蛋白制品已经上市，如蛋白 C、抗凝血酶、α1-抗胰蛋白酶和组织纤溶酶原激活剂等。部分微量血浆蛋白制品也在研发和临床试验过程中，如C1-抑制剂、补体系统Ⅰ因子、α2-巨球蛋白、血清胆碱酯酶、铜蓝蛋白以及纤维结合蛋白等。结论：尽管多种重组血浆蛋白制品已经上市，血浆来源的制品仍将具有其不可替代的特殊地位，新型血液成分制品、血浆蛋白制品的制备与鉴定技术已经成为药物研制和开发的重要组成部分。目前，我国血液制品的研发与国外存在着较大的差距，血浆综合利用率低、上市品种少是我国血液制品行业的现实，我国血液制品企业面临着机遇与挑战。

来源出版物：生物工程学报, 2011, 27(5): 730-746

入选年份：2016