皮层肌动蛋白结合蛋白Cortactin研究进展

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(1.遵义医学院，贵州 遵义 563000；2.遵义医学院第三附属医院，贵州 遵义 563000)

皮层肌动蛋白结合蛋白(cortical actin binding protein，Cortactin)是一种与微丝直接相互作用的蛋白质，在90年代早期作为酪氨酸蛋白激酶Src 80/85-kDa的直接底物而被发现的[1]，1993年Cortactin和F-actin之间的相互作用在得到证实，鉴于其丰富的皮层结构，如膜褶皱和片状伪足，以及其与F-actin的结合，故创造了Cortactin的名字[2]。目前Cortactin的研究主要涉及肿瘤的侵袭和转移过程中，近年来，该蛋白在肿瘤外的作用也慢慢受到关注。

1 Cortactin结构及编码基因特点

人类Cortactin是由CTTN基因编码(以前称EMSl基因)，该基因位于llql3染色体。推导出来的氨基酸序列显示cortactin有三个主要可区分的结构域：含有DDW-Arp2/3结合基序的N端富含酸性氨基酸的结构域，即N末端酸性域(Nterminal acidicregion,NTA)，DDW-Arp2/3结合位点和肌动蛋白结合结构域一起通过激活Arp2/3复合物来调节F-actin聚合和收缩，两者对于肌动蛋白移动至肌动蛋白聚合位点都是必需的[3-4]。接着是6.5个37个氨基酸残基组成的F-actin重复结构域(ABRs)，cortactin功能在此处也受翻译后修饰的调节，包括PAK1，PAK3、ATAT1及HDAC6的磷酸化和乙酰化[5-8]。Uruno T等剪接变异体的研究表明重复结构域的重复数目决定了对F-actin的亲和力和调节细胞迁移的能力[9-12]。最后的是在C端的SH3结构域，SH3结构域是在各种信号蛋白质中发现的保守蛋白质模块，并介导与各种蛋白质的相互作用，如涉及肌动蛋白聚合的N-WASP，胞吞作用中的dynamin-2，细胞间相互作用中的ZO-1以及神经元生长锥中的SHANK-2[13]。在F-actin重复结构域和SH3结构域之间的蛋白质中心部分含有一个α-螺旋序列和一个富含脯氨酸的区域，含有几个易被丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化的的残基，其中三个c-Src酪氨酸磷酸化位点和三个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点，三个酪氨酸磷酸化位点Y421、Y470和Y486(人类)，在小鼠体内为Y421、Y466、/Y482，可被src、fer和c-met磷酸化，2个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点s405和s418，可被erk、pak和mlck等磷酸化[14-17]。

2 Cortactin与ARP(2/3)相互关系

Cortactin在皮层微丝肌动蛋白的组装上发挥着不可替代的作用,cortactin促进肌动蛋白的形成及其结构的维持，在体外培养细胞中,Cortactin主要分布于微丝发生活跃组装的细胞皮层区域,如片状伪足、运动细胞的前导缘、神经元中的突起树突棘以及细胞膜皱褶中[18]。Cortactin的功能的发挥依靠它与皮层肌动蛋白微丝交联同时结合与激活微丝相关蛋白2/3复合物(actin related protein2/3 complex，ARP2/3复合物)，刺激肌动蛋白分支成核，以及参与Rho家族GTP酶信号传导， Cortactin还与肌动蛋白丝结合并显著减缓细丝解聚，但其作用机制以及肌动蛋白结合与稳定之间的关系尚不清楚。研究表明，突变Cortactin的NTA结构域或重复序列结构域，则Cortactin将失去与ARP2/3复合物的结合能力，同时也将不会定位于细胞皮层，而且，用免疫电镜的方法直接观察到了皮动蛋白交联微丝肌动蛋白并且与ARP2/3复合物在运动细胞的前导缘皮层共分布的现象[19]。实验还表明：cortactin与肌动蛋白结合，以浓度依赖性方式稳定细丝[20]。这也表明Cortactin与微丝肌动蛋白的作用关系紧密。

ARP2/3复合物在微丝肌动蛋白聚合过程的取重要的调节作用,该分子复合物的活化是肌动蛋白发生核化和微丝组装的必要条件，它受到多种促核化因子(NPFs)的调控。ARP2/3复合体是由7条保守多肽链组成的分子量为220 kDa的蛋白组装体，其中包括2条肌动蛋白相关蛋白链(ARP2和ARP3)及另外5条亚基链，在运动细胞内ARP2/3复合物主要分布在肌动蛋白组装最为迅速的结构，即细胞的前导缘皮层区域；ARP2/3复合物激活后，能够调节微丝成树枝样聚合，这种聚合方式以一条主干微丝为基准，随后呈树枝状延伸形成微丝网，进而发挥其作用[21]。

在外界信号刺激下细胞发生迁移时，肌动蛋白在细胞前导缘的皮层发生核化，按照分枝端(正端)朝向质膜，负端结合到相邻微丝侧面的方式进行排列,,在现存的纤丝上形成夹角为70°的Y字型的分枝结构[22]，在细胞前导缘处形成突起,驱动细胞的运动。在这个分子事件中,肌动蛋白的重新核化是整个微丝肌动蛋白组装的限速步骤，ARP2/3复合物是肌动蛋白核化过程的主要调控物[23]，但是，研究表明ARP2/3复合物自身活性较低，其催化活性实际上还依赖于NPF的激活.WASP家族蛋白是目前了解较多的一种NPFs，在无细胞系统实验中它能将肌动蛋白单体与ARP2/3复合物结合，促进微丝生长[24]。最近发现Cortactin能够以非WASP依赖的方式更快地激活ARP2/3复合物，使新的微丝在已经存在的肌动蛋白微丝的侧面和正端形成[25]。实验证明，Cortactin的N端结构域能够直接结合ARP2/3复合物同时将其活化，Cortactin N端保守序列的突变会导致其交联和活化ARP2/3复合物能力的丧失。Cortactin的第4个重复序列和N端的酸性结构域(NTA结构域) 参与了与皮层微丝网络的相互作用[26-27]；同时研究还发现，Cortactin与肌动蛋白微丝的交联直接影响皮动蛋白对ARP2/3复合物的活化能力[28]。越来越多研究支持下面微丝肌动蛋白聚合活化机制，即Cortactin和ARP2/3复合物在突起的丝状伪足和细胞前导缘中聚集，由于皮动蛋白对两者的同时结合，加强了ARP2/3复合物与肌动蛋白微丝的相互作用，催化了分枝性核化的产生，进一步激活了微丝肌动蛋白聚合过程，导致皮层肌动蛋白组装和分枝快速形成，同时在分枝形成后，Cortactin并不与ARP2/3分离，同时抑制分枝解离，从而迅速驱动了细胞运动的发生[29]。

3 Cortactin的磷酸化

Cortactin是ERK1/2和Src激酶的底物，ERK1/2处于活动状态时，Cortactin丝氨酸残基S405和S418被磷酸化[30]，同时Src途径时酪氨酸残基Y421、Y470和Y486被磷酸化[31]。两种类型的磷酸化调节皮质醇与PRD蛋白的结合[32]以及调节膜刺激后的活性[33]。ArlekM等人通过电流分析法表明皮层蛋白磷酸化状态影响神经内分泌嗜铬细胞中胞吐作用[34]。在许多肿瘤细胞中发现cortactin磷酸化水平与细胞迁移的速度存在一定的相关性。刘等人通过构建突变及缺失的cortactin，模拟酪氨酸磷酸化，纯化GST融合蛋白，pulldown检测，结果发现磷酸化后细胞运动加快[35]。MeirsonT等实验表明，通过使用ABL激酶抑制剂阻碍伪足前体形成和cortactin磷酸化可以抑制乳腺癌转移[36]。Rosenberg BJ等结果表明Vav2需要与SH2-结构域介导的磷酸化Cortactin结合才能定位于侵袭性伪足[37]。钱飞等将外源性全长cortactin及其突变体转入结肠癌细胞内，发现cortactin的磷酸化与Tfn内吞呈时间和剂量依赖关系[38]。上述结果均表明cortactin磷酸化在细胞胞吐、内吞，癌细胞侵袭、转移的肌动蛋白聚合过程中发挥着重要调控的作用。截止到现在，该过程具体调节机制仍未完全阐明。

Cortactin的酪氨酸磷酸化通常与SH3或富含脯氨酸结构域结合的蛋白质相关，而与cortactin的氨基端功能区关系不大[39]。Cortactin SH3结构域,能与多种细胞蛋白相互作用,其中包括发动蛋白的PRD结构域、CortBP1、ZO1、N-WASP、WIP、FGD1、Cd2AP以及MIM等[40]。Cortactin在磷酸化以后和发动蛋白的分子间相互作用增强，因此推测,磷酸化可能改变Cortactin的构象。朱等人通过构建Cortactin的生物传感器,构建表达质粒并转染细胞,将细胞做荧光共振能量转移(FRET)检测,表明Cortactin在磷酸化作用后分子构象发生了改变[41]，使得SH3结构域更容易被SH3结合蛋白接近,使得增加结合的机会。

Cortactin具有多个可发生磷酸化的酪氨酸残基。Y421/Y470/Y486(该层蛋白残基为人类的，相对应的小鼠皮层蛋白残基为Y421/Y466/Y482)已被视为Cortactin磷酸化的关键酪氨酸残基。Cortactin Y421和Y470磷酸化(不是Y486)已被证明是伪足形成和肿瘤细胞侵袭过程中肌动蛋白聚合的关键[42]。很少有报道调查了每个皮层蛋白酪氨酸残基的具体贡献及其磷酸化。在九个Src家族激酶成员(SFK)中，Src，Yes和Fyn几乎每个细胞都表达，Yes负责Y421和Y470的皮层蛋白磷酸化，尤其是Y470。用磷酸酶抑制剂处理细胞可显著增强皮层蛋白的磷酸化，但似乎Y421和Y470残基对磷酸酶抑制具有不同的敏感性。在HEK293细胞中，成纤维细胞生长因子受体1的过表达选择性地磷酸化了Y470[43]。此外，在表皮生长因子诱导的皮层蛋白磷酸化中，Y470被认为是与丝切蛋白相互作用的优选酪氨酸位点[44]。上述实验表明，Cortactin的差异磷酸化是一个重要的选择步骤，用于选择性地结合皮质素相互作用伙伴和功能性结果，如细胞扩散和迁移。Anette M.H?ye 的数据也支持Y421和Y470可以差异化磷酸化[45]。因此，了解每个皮层蛋白酪氨酸残基的具体贡献，可以更好地了解Cortactin磷酸化机制。

4 Cortactin与肿瘤细胞相关性研究

目前，国内外大量的研究表明，Cortactin是一种多结构域肌动蛋白结合蛋白，可激活Arp2/3介导的分支肌动蛋白聚合。它对于在癌细胞侵袭期间形成丝状伪足结构是必不可少的。Cortactin的超表达增加伪足形成,细胞外基质降解,癌细胞的入侵。Cortactin与肿瘤的侵袭性与转移性存在正相关性，同时Cortactin与肿瘤细胞的突触膜结构密切相关。而侵袭性的肿瘤细胞产生侵袭性伪足，其功能是可降解细胞外基质，以便于肿瘤细胞的侵润与转移[46]。由于cortactin在伪足形成的每个阶段的明确作用，使得它被认为是伪足形成的标志和潜在的药物目标。ShiraiYM等通过超分辨显微镜显示伪足的形成取决于Arp2/3活性，伪足运动可能涉及肌球蛋白运动活性和肌动蛋白聚合-解聚[47]。Meirson T通过乳腺癌患者数据库的进一步蛋白质组学分析揭示了Cortactin和Abl相关基因(Arg)在所有激素、人表皮生长因子受体2(HER2)、受体状态肿瘤中的共表达，与远处转移相互关联，研究结果确立了cortactin作为预测转移性播散肿瘤预后的价值的地位[48]。He J等人通过二维电泳和质谱法检测亲代MDA-MB-231与从移植的正常人乳房组织(MDA-MB-231br)中生长的肿瘤获得的其变体亚系之间的不同蛋白质发现Ezrin蛋白和Cortactin之间的相互作用是促进癌症转移过程中上皮至间质转化(EMT)过程的新机制[49]。Bertier L等人构建两个高特异性靶向靶向cortactin纳米抗体，一个纳米抗体与肌动蛋白结合重复序列相互作用，而另一个纳米抗体靶向富含脯氨酸的区域，结果发现在细胞内表达为胞内抗体后，它们都能够在细胞质的复杂环境中追踪它们的靶标，并且在侵入形成和细胞外基质降解期间干扰皮层蛋白功能。这些数据说明使用纳米抗体助于肿瘤细胞迁移和转移的新疗法的开发[50]。Cortactin在肿瘤中的作用，可能成为潜在的肿瘤诊断与治疗靶点。

5 总结与展望

Cortactin是一种皮层肌动蛋白，是细胞骨架形成、胞内信号传导的重要蛋白质，在多种细胞过程中发挥着重要作用，如伪足的形成、胞吞、胞吞、细胞黏附，侵袭等。目前在肿瘤的侵袭及伪足的形成作用上，目前研究较多，为肿瘤的治疗提供了一种新的、可行的方向。但根据Cortactin与ARP(2/3)及其他肌动蛋白的关系，以及Brescia,G及刘等人的实验，可以推断Cortactin在鼻息肉细胞、炎性反应及人体气道分泌和收缩机制上有着重要作用，目前该领域研究甚少，且由于环境的恶化，患呼吸系统疾病的人越来越多，对Cortactin在该领域的继续探索，将对呼吸系统气道黏液的分泌提供一种新的方向。