巴斯德毕赤啤酒酵母发酵指标研究

◎ 袁丹烈

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 石首 434400）

依照中华人民共和国国家标准GB/T 4927-2008《啤酒》中的定义，啤酒是以麦芽和水为主要原料，加啤酒花，经酵母发酵酿制而成的，含有二氧化碳的，起泡的，低酒精度的发酵酒[1]。啤酒养分丰富，含有多种人体所需成分，如各种蛋白质、无机盐、维生素、易吸收的低分子糖和蛋白酶等。啤酒酵母指专门用于啤酒酿造工艺中所使用的酵母，啤酒酵母品种多，形态特点各异但大致相同。其细胞形态与其他酵母相同或相似，多为圆球体与椭球体。

1 酵母菌种性能试验

1.1 材料和试剂

啤酒麦汁，生产酵母，生理盐水，无菌水以及无菌麦汁等。

1.2 主要仪器

培养皿、10 mL无菌吸管、试管、三角瓶、比重瓶、无菌操作台、温度计、火枪、鸭嘴笔以及记号笔等。

1.3 实验步骤

（1）酵母样品扩大培养。①把酵母通过斜面移植至10 mL液体试管中。②将10 mL液体分别吸取1 mL分配至9支装有9 mL无菌水的试管中，分别标记为1～9，再分别从9支试管中吸取1 mL液体至无菌麦汁培养基中，于25～28 ℃的恒温培养箱中培养2～3 d，并观察培养基中酵母菌长势。③选择长势良好的菌落移植至5 mL液体试管中标记为1#，2#。④将试管1#，2#进行5 mL液体试管活化（分别取上清液和下部酵母泥的上面部分），分别标记为1#上清、1#下部、2#上清和2#下部（共4只试管）。⑤将④中4支试管进行固体斜面移种分别标记为（1#上上、1#上下、1#下上、1#下下、2#上上，2#上下、2#下上和2#下下）。⑥使用300 mL与500 mL三角瓶对步骤③的剩余样品进行酵母扩培试验，（不少于2个平行试验，最好活化至单样不少于1 000 mL）。

1.4 理化指标分析

①外观浓度。利用比重法求得。取一个干净的比重瓶，测得其重量；将煮沸后的蒸馏水冷却到15～17 ℃，随后装满比重瓶，放入温度计，将瓶放置于20 ℃的恒温水中浸泡15～20 min（当室温高于20 ℃时应与室温保持一致），浸泡后取出，擦干毛细管上端的水，随后盖上瓶帽；擦干瓶子外壁，称重读数。然后用少量发酵液样品润洗比重瓶数次，操作步骤同上，测得带样品的比重瓶重量，随后查相对密度附表可得到样品的外观浓度n。②发酵度。根据外观浓度求得外观发酵度：V1=(10-n)/10×100%，真正发酵度V2=V1×0.819。③双乙酰。使用邻苯二胺比色法测量，先将样品蒸馏，收集双乙酰，再将邻苯二胺加入到收集的双乙酰中，二者发生反应，生成的盐酸盐物质在335 nm的波长处有最大吸收峰，可根据吸收峰定量。④总酸。利用酸碱中和原理，用NAOH标准溶液滴定样品中的酸性物质，用酸度计（pH试纸等）测量滴定终点，根据消耗NAOH标准溶液的体积可以计算出啤酒中总酸的含量[2]。

1.5 菌种性能试验结果

①从平板长势情况看，编号9#长势较好。②由于样品不够，此次没有做多次平行试验。对样品进行理化指标分析，其结果如下。原浓度：12.95；发酵度：65.7%；双乙酰：0.044；pH值：4.64；总酸：1.72。

2 酵母扩培

2.1 材料与方法

啤酒麦汁，生产酵母，生理盐水，无菌水以及无菌麦汁等。

2.2 仪器

培养皿、10 mL无菌吸管、100 mL培养瓶、1 L培养瓶、5 L培养瓶、25 L卡氏罐、250 L汉生罐、1 500 L培养罐、10 000 L培养罐和20 m3繁殖罐。

2.3 实验室扩大培养

斜面原菌种→斜面活化→10 mL液体试管→100 mL培养瓶→1 L培养瓶→5 L培养瓶→25 L卡氏罐。

2.4 生产现场扩大培养

25 L卡氏罐→250 L汉生罐→1 500 L培养罐→10 000 L培养罐→20 m3繁殖罐→0代酵母。扩培过程必须为无菌操作，以避免污染杂菌，并且接种量要适当，避免过多浪费原料或过少导致接种失败。

2.5 扩培试验数据

根据第一次扩培结果进行1.4的菌种性能试验后，经理化分析得到的数据如表1。

表1 毕赤酵母现场扩大培养8天（3月17日至3月25日）数据表

2.6 发酵性能分析

2.6.1 啤酒酵母外观察

酵母的形态结构相对简单，器官没有复杂分化，很难区分形态，但当它们开始变异和衰亡时，通常会伴随着形态与外观特征的变化。优秀的啤酒酵母的特性通常符合以下特点：菌落形成快，大而饱满，具有光泽，颜色多为乳白色，在分离培养时容易观察。微观观察，形态为短椭圆形，形状大小一致，表面光滑，胞内含有少量的和形态不大的液泡与糖原染色体，在营养良好的前提下，培养出的优秀酵母在糖原染色后颜色很浓，深度一般超过85%。杂色素颗粒染色微观观察表明，优秀的酵母杂色素颗粒大而暗，其含量也与酵母的发酵和繁殖有联系。大多数的啤酒酵母通常都以单端芽的形式繁殖，很少会连接成链。在离开母细胞之前，芽的体积比本体小，芽与母细胞之间的垂直轴角为300°，这与许多常见的酵母芽不同[2]。

2.6.2 发酵力判断

所选择的酵母通常都拥有很强的发酵能力，而且不同品种的啤酒，发酵酵母也不一样，酵母本身也只能在一定范围内发酵。当酵母的发酵力下降时，说明其内部可能发生了突变。

2.6.3 二氧化碳失重

酵母的发酵能力越强，产生的二氧化碳越多，整体质量就越轻。在原浓度为12%的麦汁中，性能良好的啤酒酵母能达到3.6 g以上的失重量。通过对质量进行比较，可以判断发酵速率。

2.6.4 双乙酰含量

双乙酰的作用是控制啤酒风味稳定性，并判断啤酒是否成熟，是啤酒酵母的发酵副产物，它的味道俗称为馊味，所以含量不适于太高，建议低于0.07 mg·L-1或者更低[2]。

2.6.5 测定发酵度

通过测定发酵前与发酵后的糖度指标，来计算被发酵的糖的百分比，根据发酵液残糖的外观浓度可以计算出的外观发酵度，实际发酵度为根据发酵液除去酒精后，剩余的实际浓度计算出的发酵度。根据发酵程度的不同，可分为3个等级，分别是低发酵度、中发酵度和高发酵度。

2.6.6 发酵液的感官检查

在啤酒生产的过程中，酵母发酵会产生副产物，这些产物会改变成品啤酒的风味与口味稳定性，导致颜色、口感发生变化；所以，在评价啤酒酵母时，会先由经验丰富的评酒师对被测样品做感官检查，评酒师的建议是评价的一个重要指标。优秀的啤酒酵母所生产的成品啤酒，口味正常，没有其他味道，并具有正常的酒花香味。更主要的是，成品啤酒应符合该酵母所生产的啤酒的典型味道。

3 酵母总体评价

（1）该酵母最终发酵度为65.7%，达到正常水平，并且在19—23日内二氧化碳减重量皆超过1.5，证明其发酵速度较好。

（2）酵母发酵性能强劲，8 d总二氧化碳失重达到10.85 g，而实际浓度为4.64度，属于强发酵酵母。

（3）双乙酰含量0.044 mg·L-1，处于建议值范围内，对其成品风味稳定性有保障。

总体而言，毕赤啤酒酵母是一款发酵性能强，适宜于大型生产的啤酒酵母，符合优良酵母的条件，发酵强劲，双乙酰还原稳定，根据发酵度测定为高发酵度酵母。