94个茶树种质资源遗传多样性与亲缘关系分析

杨 军，王让剑，孔祥瑞，郑国华，邱陈华

(福建省农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心福建分中心/农业部福建茶树及乌龙茶加工科学观测实验站，福建 福安 355015)

茶树是山茶科山茶属茶组的多年生常绿木本植物[1]，且为常异花授粉植物，具有高度杂合性，其遗传基础较为复杂，种质资源的农艺性状与加工品质鉴定难度大、时间长，对茶树种质资源保护与新品种选育工作造成较大的困难。近些年，EST-SSR来自于功能基因，具有多态性高、共显性、技术简单、重复性好等特点[2-5]，在茶树遗传多样性、亲缘关系分析、群体结构分析、种质资源鉴定筛选与辅助育种中广泛应用[6-9]。对茶树种质资源遗传多样性与亲缘关系分析是野生茶树种质初步鉴定的重要手段。黄晓霞等[10]的研究结果说明千家寨不同海拔梯度上野生茶树居群遗传多样性随着海拔梯度的递增，居群的遗传多样性呈现出低-高-低的分布；毛娟等[11]发现样本量在40个时，能较好地反映云南白莺山地区茶树资源的遗传多样性；张明泽等[12]认为黔南野生茶树资源间的遗传差异较大，遗传基础较宽，具有丰富的遗传多样性。郭燕等[13]研究表明40个贵州古茶树资源有较高的遗传多样性，主要是由遗传因素和地理位置不同引起。周萌等[14]认为树龄3200年的香竹簧茶树王与野生茶树、栽培型茶树品种之问的遗传关系较远。姜晓辉等[15]研究表明广东历史名茶茶树群体罗坑与马图群体间在过去的某个时间可能有过基因交流。茶树种质资源的群体结构分析也有较多研究。王丽鸳等[16]认为龙井群体的遗传分化程度较低。姚明哲等[17]认为江北茶区主要省份间茶树种质的遗传分化程度低。乔婷婷等[18]认为茶树地方品种、选育品种(系)具有相对独立的群体结构，选育品种(系)根据亲缘关系的不同形成不同的类群。吴晓梅等[19]认为乌龙茶品种与绿茶品种间的遗传结构存在差异。本试验对福建省主要审(鉴)定品种、茶树自然杂交后代群体、地方搜集资源群体进行个体材料的亲缘关系、遗传多样性与群体结构分析，以期为茶树种质初步鉴定与分子标记辅助育种提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试材料来源于福建省农业科学院茶叶研究所，福建省茶树种质资源及其自然杂交后代共94个(详见表1)，采集各个材料一芽二叶鲜叶后用液氮迅速冷冻处理，保存在-70℃冰箱中备用。

表1 94份供试材料的名称与来源

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用改进的CTAB法[20]提取茶树基因组DNA。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行茶树基因组分子量大小检测，用756-MC型紫外分光光度计测定茶树基因组DNA的纯度(OD260/280比值)。

1.2.2 引物合成 参照文献[21]引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息见表2。

1.2.3 PCR扩增和产物鉴定 PCR反应体系为：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL(Mg2+)，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游primer(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL(0.5U)，模板DNA 1μL。PCR反应于美国ABI-9600型扩增仪上进行，热循环程序为：94℃预变性4 min，使模板DNA 充分变性，然后进入下列温度循环：94℃变性45 s，不同温度条件退火60 s，72℃延伸75 s，重复35个热循环；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物统一在反向引物(R)的5′段标记荧光(FAM/TAMRA)，由上海百力格生物科技有限公司合成。扩增产物0.5 μL，GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL，HiDi 9 μL，混匀后使用ABI公司3730XL进行毛细管电泳。

1.2.4 群体结构分析 使用Struture 2.3.4[22]进行群体结构分析，先计算各材料归属第k亚群的概率Q值。使用混合模型K值从3设置到10模拟群体结构，每一个K值重复5次。将MCMC迭代设为100000次，初始burn-in次数为100000。

1.2.5 数据处理 采用ABI公司的GeneMapper4.0软件，选择GeneScanTM500 ROXTM作为分子量标准，对每一个扩增出的条带记录大小。运用PopGen3.2软件计算Shannon信息指数(I)和Nei’s基因多样性指数(H)。运用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序进行聚类分析。

表2 17对 SSR 引物及其序列

2 结果与分析

2.1 94个材料间亲缘关系分析

从图1上看出，白鸡冠与其自然杂交后代4个聚类在一起，说明白鸡冠自然杂交后代遗传组成主要来自于母本白鸡冠，后代遗传相对稳定(i)；福云6号与其自然杂交后代分为2个类群，其中，第一类群B1、B2、B3与福云6号(B11)聚类在一起(ii)，B4、B5、B8、B10聚类在一起，推测B1、B2、B3与福云6号(B11)亲缘关系较近；金牡丹(C11)及其所有自然杂交后代都聚类在一起(iii)，说明其后代遗传组成主要来自于母本金牡丹；金观音(D11)与D2、D4、D5、D6、D8聚类在一起(iv)，推测其与母本金观音亲缘关系较近；9个材料紫玫瑰自然杂交后代聚类在一起(v)，却没有和亲本(E11)聚类在一起，推测父本为同一类型材料，且遗传组成主要来自于父本；7个悦茗香自然杂交后代与悦茗香(F11)聚类在一起(vi)，说明其后代遗传成分主要来自于母本悦茗香；武夷山种质资源G1、G3、G4、G6、G10、H1、H2、H3、H10、与肉桂聚类在一起(vii)，推测与肉桂亲缘关系较近；武夷山地方资源G5、H6、H8、H5、H11与大叶乌龙(L2)、梅占(L5)、矮脚乌龙(L8)、白芽奇兰(L10)聚类在一起(viii)，武夷山种质资源与这些品种遗传组成较为相似；武夷山种质资源H7与所有参试材料都没有聚类在一起，说明H7遗传组成相对特殊。

2.2 群体间遗传多样性比较与亲缘关系分析

从表3中看出，Shannon遗传多样性指数最高的为群体7、群体8(武夷山茶树种质资源)，且高于群体9(福建省茶树品种)；6个自然杂交后代群体遗传多样性指数最高的是福云6号自然杂交后代，推测是由于母本福云6号有云南茶树种质资源遗传基础，遗传多样性相对广泛；白鸡冠、悦茗香、紫玫瑰的自然杂交后代群体遗传多样性相当，略高于金观音、金牡丹的遗传多样性指数。

图1 遗传相似系数聚类图Fig.1 Dendrogram on genetic similarity

Hardy-Weinberg遗传偏离指数D主要反映Ho(观测杂合度)和He(期望杂合度)之间的平衡关系，D值越接近0，基因型的分布就越接近于平衡状态，D值大于0说明存在杂合子过剩，D值小于0，说明存在杂合子缺失现象[23]。从表3可以看出，6个自然杂交后代群体Ho高于对应的He，D值大于0，属于亲本单一，杂合子过剩现象；武夷山2个地方种质资源群体Ho低于对应He，D值小于0，属于试验材料有限杂合子缺失现象。

从群体聚类图2看出，群体1、群体6、群体7与群体8聚类在一起，说明这4个群体亲缘关系相对较近，悦茗香自然杂交后代群体的父本可能来自于闽北武夷山茶树种质资源；群体2、群体9、群体3与群体4聚类在一起，推测福云6号自然杂交后代群体的父本可能来自于闽南铁观音、黄棪等高香茶树种质资源。

2.3 94个材料群体结构分析

采用Struture 2.3.4软件对94个茶树品种(系)进行系统解析，当K=3时△K值为最大值，从图3中看出，94个茶树品种(系)分为3个类群。参考刘志斋[24]等以类群属性比率50%为标准的划分依据，94个茶树品种(系)分为S1、S2、S3类群，S1类群从品种来源看，代表性材料为黄棪、铁观音，主要材料为金观音及其自然杂交后代、金牡丹及其自然杂交后代，体现的是黄棪、铁观音等闽南高香资源类群属性；S2类群从品种来源看，代表性材料为白鸡冠、福云6号、福鼎大白茶、悦茗香，主要材料为白鸡冠、福云6号、紫玫瑰与悦茗香自然杂交后代，体现的是乌龙茶与绿茶资源的混合类群属性；S3类群从品种来源看，代表性材料为肉桂、矮脚乌龙，主要材料为武夷山茶树种质资源，体现闽北优异乌龙茶种质资源属性(详见表4)。

表3 9个群体遗传多样性

图2 群体遗传相似系数聚类图Fig.2 Dendrogram on genetic similarities of groups

图3 假设K=3时群体按照所估计的成分(Q)值的结构分析结果Fig.3 Membership coefficients of 3 clusters based on assumption of cluster number (k=3) and accessions sorted by individuals

表4 94个材料的群体结构

(续表4)

第一类群铁观音、黄棪第二类群白鸡冠、福云6号、福鼎大白茶、悦茗香第三类群肉桂、矮脚乌龙代号组成1组成2组成3代号组成1组成2组成3代号组成1组成2组成3C90.98540.00760.007B70.38050.57460.045H100.01010.010.9799D10.57590.41090.0131B80.40320.59020.007H110.0070.01150.9815D110.95390.03470.0114D100.36220.55420.084H20.02610.01550.9584D20.98650.00750.006E10.15740.80540.037H30.0080.01040.9816D30.98530.00790.0069E100.04040.94590.014H40.01250.08860.8989D40.98550.00850.006E20.05540.93090.014H50.01480.01790.9674D50.98550.00840.0061E30.17420.56510.261H60.01140.01590.9727D60.97340.01820.0084E40.15630.82420.02H70.0120.04350.9445D70.98460.00930.0061E50.15710.83070.012H80.0070.01420.9788D80.98590.0080.0061E60.17270.80780.02H90.00930.15720.8335D90.9840.00910.0069E70.05210.92940.019L100.46150.02040.5181E110.68540.18570.1289E80.33910.64090.02L20.11750.18890.6937F70.58810.24860.1633E90.03440.95540.01L90.14610.34850.5054L110.76330.19550.0412F10.02180.83820.14L80.46680.02560.5076L30.58060.30430.1151F100.0070.92750.066平均值0.057290.04560.8971074L40.94260.03360.0237F110.01250.70370.284L50.53790.1320.3301F20.0110.96440.025平均值0.87040.0770930.0525F40.00990.9790.011F50.01190.96450.024F60.0080.91490.077F80.0190.95090.03F90.03080.9430.026L10.01650.89940.084L60.01050.93980.05平均值0.11820.8360.05

3 讨论

3.1 武夷山种质资源初步鉴定

武夷山茶树种质资源丰富，据历史记载有1187种，其中铁罗汉、水金龟、白鸡冠、半天妖等四大名枞就是从武夷山的菜茶中选出[25]，武夷菜茶在世界茶树植物学分类学上占有重要地位，被称为武夷种、武夷亚种或武夷变种[26]。刘振[27]、朱晨[28]、姜燕华[29]分别对福建茶树种质资源进行遗传多样性分析，Shannon多样性指数平均值分别为1.16、0.368、0.877，本试验中2个武夷山茶树种质资源群体的Shannon多样性指数平均值分别为1.219、1.136，参试武夷山茶树种质资源群体遗传多态性相对最丰富；武夷山种质资源2个群体间没有明显的差异性，群体亲缘关系较近；22个资源主要分为2个类型，第1个类型9个材料与肉桂亲缘关系较近，第2个类型5个材料与大叶乌龙(L2)、梅占(L5)、矮脚乌龙(L8)、白芽奇兰(L10)构成的小群体聚类在一起，遗传组成较相似；其中，武夷山种质资源H7与所有参试材料都未聚类在一起，推测参试材料H7遗传基础较为特殊，需进一步观察与试验。

3.2 6个自然杂交后代初步鉴定

白鸡冠自然杂交后代遗传基础与白鸡冠多相一致；紫玫瑰自然杂交后代未与紫玫瑰聚类在一起，推测其遗传基础受父本影响较大；悦茗香自然杂交后代遗传组成与悦茗香一致，群体与武夷山地方资源亲缘关系较为接近，推测悦茗香自然杂交后代的父本是武夷山种质资源类型；福云6号自然杂交后代分为2种类型，第1个类型3个材料与福云6号聚类在一起，遗传组成偏向绿茶，另外6个材料与铁观音、黄棪等高香乌龙茶品种聚类在一起，推测其父本为铁观音、黄棪等高香乌龙茶品种资源；金观音、金牡丹及自然杂交后代与铁观音、黄棪属于1个类型。