适制乌龙茶品种新梢主要品质化学轮廓的模式识别研究

陈 林，宋振硕，陈 键，王丽丽，余文权，尤志明*

(1.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015；2.国家茶树改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

福建是乌龙茶的主产区和发祥地，拥有丰富多样的乌龙茶种质资源。适制乌龙茶鲜叶一般采摘自顶芽形成驻芽的中、小开面二至四叶茶树嫩梢，这与其他茶类对鲜叶原料的嫩度要求存在较大差异。普遍认为，叶质硬而脆、角质层较厚、叶下表皮具有分泌功能的腺鳞结构是适制乌龙茶鲜叶的必要物理指标[1]。杨伟丽等[2]根据17个茶树品种鲜叶的乌龙茶适制性研究认为，叶片宽、梗粗、节间短、叶长/叶宽值小、梗粗/节长值大、叶片厚、上表皮厚和栅栏组织厚等8项性状是乌龙茶品种鲜叶的重要形态结构特征。此外，严学成[3]通过8个乌龙茶品种不同叶位叶片的解剖结构和叶绿体色素含量测定结果发现，随着叶位的增加，叶绿体结构逐渐分化，叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和类胡萝卜素含量增加，并伴随着脂肪性质球增多，叶绿体中的淀粉颗粒扩大，且较老叶片叶肉细胞常见油滴或造油体。虽然已有报道初步描述了适制乌龙茶鲜叶的基本理化特性[4]，但鲜见样品制备方法的具体说明或无一致的新梢采制标准[5, 6]。据笔者前期研究表明，铁观音、黄棪等4个乌龙茶品种茶鲜叶在春季新梢伸育过程中主要品质成分相较其在清香型乌龙茶加工过程发生了更为明显的起伏变化[7]。乌龙茶品种常为多茶类兼制用种，为揭示其鲜叶主要品质化学轮廓的基本特征，本试验以国家或省级审(认、鉴)定绿茶品种春季鲜叶为对照，对福建代表性乌龙茶品种春季和秋季鲜叶的主要品质生化成分进行了检测分析及可视化模式识别，以期为乌龙茶品种生化鉴定和种质资源的创新利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试鲜叶均采自集中分行种植于福建省茶树资源圃4～5龄试验茶园(北纬27°13′57″，东经119°34′31″)的10个绿茶品种春季第一轮新梢与10个乌龙茶品种春季和秋季第一轮新梢。春茶和秋茶样品采摘时间分别为3月26日～5月3日，10月9日～10月24日。绿茶品种包括：(1)国家认(鉴)定绿茶品种：福鼎大白茶、福鼎大毫茶、福安大白茶、福云6号、福云7号、福云10号和霞浦春波绿；(2)福建省审定绿茶品种：九龙大白茶、霞浦元宵茶和早春毫。乌龙茶品种按产地来源可划分为：(1)闽北品种：肉桂、水仙、大红袍和矮脚乌龙；(2)闽南品种：铁观音、黄棪、梅占和白芽奇兰；(3)闽东新品种：茗科1号(金观音)和黄观音。采摘标准：一芽二、三叶(简称幼嫩鲜叶)和中、小开面二至四叶(简称成熟鲜叶)。标准品：没食子酸单水合物(纯度>99%)和咖啡因(USP/BP级)，Aladdin试剂；L-谷氨酸(BR级，纯度≥98.5%)和葡萄糖(分析纯)，沪试试剂。甲酸溶液(49%～51%，HPLC级，Fluka 试剂)、甲醇和乙腈(HPLC级，Sigma-Aldrich试剂)。除特殊要求外，其余均为国产分析纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 茶样制备 将电热式碧螺春烘干机升温至180℃，开启风机，投入鲜叶150～180 g，进行热风杀青[先闷后透，10 min(≥100℃)]，再将茶样转入电热烘箱，80℃烘至足干，冷却后真空密封包装，于-20℃冷冻保存备用[8]。各供试茶样的具体编码及其鲜叶来源见表1。

表1 茶样编码及其鲜叶来源

(续表1)

表1 茶样编码及其鲜叶来源

1.2.2 茶样检测 水浸出物(WEs)含量：参照GB/T8305-2013，采用重量法测定；茶多酚(TPs)含量：参照GB/T 8313-2008，采用福林酚(Folin-Ciocalteu)比色法测定；游离氨基酸(FAAs)总量：参照GB/T 8314-2013，采用茚三酮比色法测定；可溶性糖(WSSs)总量：采用蒽酮比色法测定[9]。咖啡因(CAF)含量：采用TSKgel ODS-100Z 色谱柱(150 mm×4.6 mm I. D.，粒径：5 μm，日本Tosoh公司)，以0.2%甲酸水溶液(v/v)和甲醇为流动相进行高效液相色谱检测分析[10]。

1.2.3 统计分析 将WEs、TPs和FAAs等主要品质生化成分检测结果及其组合变量[酚氨比(RPA)[11]、苦涩成分(TPs+CAF)/鲜甜成分(FAAs+WSSs)比值(RNP)]导入到ChemPattern 2017[科迈恩(北京)科技有限公司]进行基于主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的可视化模式识别，并采用SIMCA 15.0.2(德国Sartorius Stedim Biotech集团)对建立的PLS-DA分类模型进行质量评价[包括潜变量个数的确定、交叉验证预测残差的方差分析(CV-ANOVA)和置换检验(Permutation test)等]。另应用IBM SPSS Statistics 24.0(美国IBM公司)，通过双因素方差分析(Tow-way ANOVA)考察了各茶树品种的适制特性、采摘季节和芽叶嫩度对供试茶样主要品质生化成分的内在影响及不同类群供试茶样主要品质生化成分的含量差异。

2 结果与分析

2.1 乌龙茶和绿茶品种春季鲜叶主要品质化学轮廓的模式识别

基于春季供试茶样WEs、TPs和FAAs等主要品质生化成分检测结果及其组合变量(RPA和RNP)的主成分分析(PCA)结果表明，绿茶品种春季成熟鲜叶样主要品质成分的化学模式在前2个主成分(PC1×PC2)二维视图的平面分布较为离散，但不同来源春季鲜叶样并无明显的类群区分(图1-A)。进一步采用基于偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的模式识别结果显示，全部春季供试茶样主要品质成分的化学模式可用2个潜变量来刻画，其方差贡献度分别为38.55%(LV1)和25.28%(LV2)，累积方差贡献度为63.83%。40份春季供试茶样主要品质成分的化学模式在潜变量(LV1×LV2)二维视图的平面分布中可按不同茶树品种(适制特性×芽叶嫩度)划分成相互独立的4个类群，即绿茶品种春季幼嫩鲜叶样(YGS)、绿茶品种春季成熟鲜叶样(MGS)、乌龙茶品种春季幼嫩鲜叶样(YOS)和乌龙茶品种春季成熟鲜叶样(MOS)(图1-B)，其中R2X、R2Y和Q2Y[12]分别为0.638、0.493、0.455。另由主成分载荷可以看出，CAF、RNP和FAAs，FAAs、WEs和TPs，WSSs和RPA分别是YOS、YGS、MGS有别于其他茶样类群的主要相关因子。交叉验证预测残差的方差分析和置换检验(n=200)对模型的有效性检验结果显示，该模型具良好的预测能力(p=3.60×10-9)，且不存在过拟合现象。

图1 基于绿茶品种和乌龙茶品种春季鲜叶主要品质成分的模式识别Fig.1 Pattern recognition based on functional constituents in spring shoots of green tea and oolong tea cultivars注：变量采用UV-scaling标度化预处理。A：主成分分析；B：偏最小二乘判别分析。下同。

不同茶树品种基于(适制特性×芽叶嫩度)的双因素方差分析结果表明，春季绿茶和乌龙茶品种鲜叶样的TPs、CAF和WSSs含量有极显著差异；幼嫩鲜叶和成熟鲜叶的CAF含量存在显著性差异，而WEs、TPs、FAAs和WSSs含量则达到极显著差异。此外，不同茶树品种(适制特性×芽叶嫩度)对CAF含量有明显的互作效应。多重比较分析结果显示，YGS有较高的WEs和TPs含量；MGS有较高的WSSs和较低的CAF、FAAs含量；YOS有较高的FAAs和较低的WSSs含量；MOS有较高的CAF和较低的WEs、TPs含量(见表2)。

2.2 乌龙茶品种春季和秋季鲜叶主要品质化学轮廓的模式识别

由基于乌龙茶品种供试茶样WEs、TPs和FAAs等主要品质生化成分检测结果及其组合变量(RPA和RNP)的主成分分析(PCA)结果可以看出，40份乌龙茶品种供试茶样主要品质成分的化学模式在前2个主成分(PC1×PC2)二维视图的平面分布中可按(采摘季节×芽叶嫩度)划分成相互独立的4 个类群，即乌龙茶品种春季幼嫩鲜叶样(YOS)、乌龙茶品种春季成熟鲜叶样(MOS)、乌龙茶品种秋季幼嫩鲜叶样(YOA)和乌龙茶品种秋季成熟鲜叶样(MOA)(图2-A)。基于偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的模式识别结果显示，全部乌龙茶品种供试茶样主要品质成分的化学模式可用3 个潜变量来刻画，其方差贡献度分别为34.32%(LV1)、37.46%(LV2)和14.49%(LV3)，累积方差贡献度为86.27%；通过潜变量(LV1×LV2)二维视图可进一步放大上述4个茶样类群的组间差异(图2-B)，其中R2X、R2Y和Q2Y分别为0.863、0.559、0.483。另由潜变量载荷可以看出，FAAs和RNP，TPs和WEs，RPA和WSSs分别是YOS、YOA和MOA区别于其他茶样类群的主要相关因子。交叉验证预测残差的方差分析和置换检验(n=200)对模型的有效性检验结果显示，该模型具良好的预测能力(p= 1.07×10-6)，且不存在过拟合现象。

图2 基于乌龙茶品种鲜叶主要品质成分的模式识别Fig.2 Pattern recognition based on functional constituents in shoots harvested from oolong tea cultivars

不同乌龙茶品种基于(采摘季节×芽叶嫩度)的双因素方差分析结果表明，春季和秋季鲜叶样的TPs含量有显著性差异，且WEs、FAAs和WSSs含量达到极显著差异；幼嫩鲜叶和成熟鲜叶的WEs、TPs、FAAs和WSSs含量均有极显著差异。此外，不同乌龙茶品种的(采摘季节×芽叶嫩度)对WEs、FAAs含量存在明显的互作效应。多重比较分析结果显示，YOA有较高的WEs、TPs和CAF含量；MOA有较高的WSSs和较低的CAF含量(见表2)。

表2 不同类群茶样的主要品质生化成分含量

注：同一列数值右上方标注有不同小写字母表示差异达显著性水平(p<0.05)，标注有不同大写字母表示差异达极显著水平(p<0.01)。

3 讨论

在茶树新品种区域试验过程中，主要通过选择合适的对照种(如绿茶为福鼎大白茶，乌龙茶为黄棪，红茶为英红1号)，对新选品种的形态特征、生物学特性、产量、抗性以及主要化学成分含量、茶类适制性和茶叶品质特点等进行长达6～7年的系统观测[13]。然而这种基于单一或少数对照种以评价其他新选品种(系)的茶树品种选育和鉴定模式，较难体现候选品种与已审(认、鉴)定品种群体性状的总体差异和应用推广价值。因此，选用多个已审(认、鉴)定品种为对照，通过统计模式识别将能更为客观地反映候选品种(系)个体或群体的性状特征和分类归属。茶叶生化组成复杂多样，多变量和单变量统计模式识别系群体样本多指标分析和关键指标筛选的常用化学计量方法。单变量统计分析侧重于衡量单一指标变化，多变量统计分析则能同时考察所有指标，并可寻找出各指标间的相互联系[14]。乌龙茶和绿茶属福建主产茶类，通过茶鲜叶(一芽二、三叶)儿茶素类和嘌呤碱HPLC指纹图谱检测，并基于主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)可对绿茶和乌龙茶品种进行良好的类群区分[8]。从本试验可以看出，在生长树龄、自然环境和栽培管理条件相较一致的条件下，基于偏最小二乘判别分析(PLS-DA)能有效刻画出不同嫩度绿茶和乌龙茶品种春季鲜叶主要品质化学轮廓的群体差异，另基于主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)均可直观呈现采摘季节和芽叶嫩度对乌龙茶品种鲜叶主要品质化学轮廓的影响。由此可见，虽然乌龙茶品种鲜叶(一芽二、三叶)亦可加工成其他茶类产品，但其鲜叶主要品质化学轮廓仍有其独立的群体特征。选用多个绿茶品种为对照，通过不同嫩度春季茶鲜叶主要品质生化成分的检测分析，并结合基于线性变换的多维统计模式识别将可作为一种乌龙茶品种筛选和鉴定的有效方法。