加热处理对大果山楂果肉褐变的影响

张巧，陈振林，潘中田，刘艳，段振华*

1(贺州学院 食品与生物工程学院，广西 贺州，542899) 2(贺州学院 食品科学与工程技术研究院，广西 贺州，542899)

大果山楂由小果南山楂经过选育嫁接而成，是我国特有的药果兼用树种，在广西地区多有种植。与普通山楂相比，大果山楂果粒大，最大可达300 g左右；总酚、黄酮含量优于小果山楂，营养丰富；果皮为青色，果肉白色，水分足，口感较好[1-2]。大果山楂含有黄酮和花青苷两大类酚类物质，具有降血脂、降血糖、抑菌、抗肿瘤、防治心血管疾病的功效[3-5]。

本研究从酶促褐变、美拉德反应和抗坏血酸氧化反应3个方面考察了大果山楂的褐变机理，为抑制大果山楂的褐变提供理论依据，进而提高山楂的加工品质及储运性能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大果山楂，从贺州市水果店购买；聚乙烯吡咯烷酮：分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；福林酚试剂：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；愈创木酚、邻苯二酚、抗坏血酸、3,5-二硝基水杨酸、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

722N分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；HWS12型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；5424R高速冷冻离心机，Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大果山楂加热处理

选取新鲜山楂一个，清洗干净，去核，均匀切块，每块质量约5 g，分别在煮沸的去离子水中加热0、0.5、1、1.5、2 min，立即置于冰水中冷却。

1.3.2 山楂褐变度的测定[6]

将加热后的山楂块分别研磨均匀，4 000 r/min离心20 min，取上清1.0 mL，加1.0 mL的体积分数95%乙醇，摇匀，420 nm处比色。

1.3.3 山楂多酚氧化酶、过氧化物酶活性的测定

取加热处理后的山楂2 g，加入8 mL磷酸盐缓冲液(50 mmol/L、pH 6.5、1%的聚乙烯聚吡咯烷酮)，冰水中研磨成浆，4 ℃下避光浸提2 h，离心，上清液测定酶活。

多酚氧化酶活性的测定采用邻苯二酚法[4]。反应体系为磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 6.5)0.5 mL，0.1 mol/L邻苯二酚1.5 mL，酶液0.15 mL，420 nm处比色，以每分钟OD值变化0.01作为1个酶活力单位。

过氧化物酶活性的测定采用愈创木酚[5]。反应体系为0.05 mol/L的愈创木酚1.5 mL，2%的H2O20.5 mL，酶液0.5 ml，470 nm处比色，以每分钟OD值变化0.01作为1个酶活力单位。

1.3.4 山楂总酚、黄酮含量的测定

取加热后的山楂2 g，加入8 mL体积分数80%甲醇溶液进行研磨，室温下提取20 min，4 000 r/min离心10 min，将分离后的沉淀重复上述提取过程1次，合并上清液，测定总酚、黄酮含量。

总酚含量的测定采用福林试剂法[6]。在离心管中分别加入一定量的样品溶液，加水补足至4.0 mL后摇匀。然后依次加入福林酚试剂0.25 mL、质量分数20%Na2CO3溶液0.75 mL。75 ℃保温15 min，760 nm处比色。

黄酮含量的测定参照李维莉等方法[7]。吸取一定量的样品溶液，加入质量分数5%NaNO2溶液0.3 mL，质量分数10%的Al(NO3)30.3 mL，6 min后加入质量分数4%NaOH溶液4 mL，体积分数95%乙醇溶液补充至10 mL，静置15 min，510 nm处比色。

1.3.5 山楂花青苷含量的测定

参照文献[8-9]并稍作修改。加热后的山楂2 g，用6 mL的酸性乙醇[V(体积分数80%乙醇)∶V(1.25 mol/L HCL)=85∶15]60 ℃避光浸提3 h，535 nm处比色。

1.3.6 山楂抗坏血酸含量的测定

参照文献[10]并稍作修改。加热2 min的山楂块2 g，分别在空气中放置0、3、6、12、18 h，加入4 mL的体积分数1%HCl，研磨均匀，离心，取上清液测定抗坏血酸含量。

在试管中加入一定量的样品溶液，再加入50mmol/L的FeCl3120 μL，5 mmol/L的K3Fe(CN)60.5 mL，补水至5 mL，40 ℃反应12 min，698 nm处比色。

1.3.7 山楂还原糖含量的测定

采用3,5-二硝基水杨酸法[11]。加热后的山楂2 g，加6 mL的去离子水，50 ℃浸提15 min，离心，取上清液测定还原糖含量。

在1 mL的稀释上清液，加1 mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水中准确加热5 min，流水冷却后补水至10 mL，540 nm处比色。

1 结果与分析

1.2.1 加热时间对山楂褐变度的影响

褐变度是最能直接反映大果山楂果肉褐变程度的指标。将山楂在沸水中加热0、0.5、1、1.5和2 min，山楂果肉的褐变度如图1所示。未经沸水加热的山楂块，研磨后的褐变度吸光值达到0.727，褐变非常严重。随着沸水加热时间的增加，山楂褐变度明显降低，且褐变度下降速率是先快后慢。这是由于沸水加热能有效降低山楂果肉中与褐变相关酶的活力，从而对山楂褐变有一定的抑制作用。在一定时间范围内，加热时间越长，酶促褐变程度越低。因而，在食品工业生产中，加热和烫漂是抑制酶促褐变的常用方法[12]。

图1 不同加热时间对山楂褐变度的影响Fig.1 Effect of heating time on browning degree of Malus domeri (Bois) Chev.

1.2.2 加热时间对山楂多酚氧化酶、过氧化物酶活性的影响

果蔬酶促褐变与多酚氧化酶、过氧化物酶活力密切相关[14]。在沸水中加热不同时间，山楂多酚氧化酶、过氧化物酶活性的变化情况如图2所示。

图2 不同加热时间对山楂多酚氧化酶、过氧化物酶活性的影响Fig.2 Effect of heating time on polyphenol oxidase and peroxidase activity of Malus domeri (Bois) Chev.

随着加热时间的延长，山楂多酚氧化酶、过氧化物酶活性明显降低，且山楂过氧化物酶比多酚氧化酶活性下降得更快，沸水加热1.5 min，过氧化物酶完全失活，加热2 min，多酚氧化酶也几乎完全失活。山楂多酚氧化酶、过氧化物酶的活性与山楂褐变度呈正相关关系。加热时间越长，酶活性越低，山楂褐变程度也越低。由于沸水加热对山楂营养成分有一定的损失，且容易造成山楂的失重[15]，考虑2 min作为大果山楂的灭酶时间。

1.2.3 加热时间对山楂总酚、黄酮及花青苷含量的影响

黄酮和花青苷是山楂中最具代表性的酚类物质。当山楂被切开后，果肉与空气接触，山楂中的酚类物质在酶的作用下氧化成醌，进而聚合形成褐色素，因而酚类物质是酶促褐变反应的作用底物[16-17]。山楂在沸水中加热不同时间，总酚和黄酮及花青苷含量的变化如图3所示。

图3 不同加热时间对山楂总酚、黄酮及花青苷含量的影响Fig.3 Effect of heating time on phenols, flavone and anthocyanin content of Malus domeri (Bois) Chev.

由图3-(a)可知，沸水加热时间越长，总酚含量明显越多，总酚含量与山楂褐变度呈负相关关系。原因在于未经加热处理的山楂块，短时间内的褐变使得山楂总酚含量迅速下降，因而总酚含量较低；而经沸水加热一定时间的山楂块，山楂中的酚酶活性降低，酶促褐变反应受到一定的抑制，总酚含量反而较高。此外，山楂黄酮含量的变化趋势与总酚相似，随着加热时间的增加，黄酮含量越多，原因很可能是山楂中的酚酶主要作用于黄酮类物质，从而进行酶促反应，因而加热时间增加，酚酶活力减弱，黄酮参与的酶促褐变受到抑制，黄酮化合物含量较多。与此同时，随着沸水加热时间的增加，山楂花青苷含量的变化如图3-(b)所示。与未加热处理的山楂相比，加热山楂的花青苷含量有少量的降低。原因很可能是煮沸能增加山楂色素的溶解度，因而随煮沸时间的增长，山楂中的花青苷含量稍微减少。

1.2.4 灭酶后山楂褐变度的变化

根据1.2.2的实验结果，将切块后的山楂在沸水中加热2 min后，山楂多酚氧化酶、过氧化物酶失去活性。灭酶后的山楂块在室温存放过程中的褐变度变化情况如图4所示。

图4 加热后山楂在不同保存时间下的褐变度变化Fig.4 Browning degree in Malus domeri (Bois) Chev. of enzyme inactivation with different storage time

山楂块分别存放0、3、6、12、18 h，褐变度吸光值变化不显著。经过加热灭酶处理后，酶促褐变反应受到完全抑制，此时山楂块的褐变度不随时间发生变化，间接说明山楂快几乎不发生非酶促褐变。

1.2.5 灭酶后山楂抗坏血酸和还原糖含量的变化

将山楂块在沸水中加热2 min后存放，此时酶促褐变完全受到抑制。山楂中的抗坏血酸、还原糖含量变化情况如图5所示。

图5 加热后山楂保存不同时间下的抗坏血酸、还原糖含量的变化Fig.5 Ascorbic acid and reducing sugars content in Malus domeri (Bois) Chev. of enzyme inactivation with different storage time

山楂块分别存放0、3、6、12、18 h，山楂中的抗坏血酸、还原糖含量不发生显著变化，这与1.2.4山楂褐变度的变化结果一致，说明大果山楂经灭酶后在保存过程中几乎不发生抗坏血酸氧化反应和美拉德反应，进一步说明大果山楂的褐变与非酶促褐变无关。

2 结论

在一定时间范围内，沸水加热时间越长，大果山楂果肉的褐变度越低。究其原因，是由于加热导致山楂多酚氧化酶、过氧化物酶活性降低，从而抑制了酶促褐变反应。加热时间增长，山楂褐变程度降低，总酚、黄酮含量较未加热山楂高，花青甘含量有少量的减少。将山楂块沸水加热2 min，多酚氧化酶、过氧化物酶基本失去活性，灭酶后山楂块在存放过程中的褐变度、抗坏血酸和还原糖含量不发生显著变化。可以得出结论：大果山楂果肉的褐变是由酶促褐变引起的，与非酶促褐变无关。因此，在今后对大果山楂果肉进行褐变抑制研究时，应重点考虑在不损失山楂营养成分的前提下抑制酶活性，从而为解决大果山楂果肉严重褐变这一难题提供一定的参考依据。

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