盐裂皮肤间接免疫荧光及BP180 NC16a酶联免疫吸附测定在大疱性类天疱疮诊断中的意义

李锁 李志量 荆可 向睿宇 张寒梅 冯素英

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院皮肤科 江苏省皮肤病与性病学重点实验室

大疱性类天疱疮（bullous pemphigoid，BP）是一种自身免疫性表皮下水疱病［1］。BP典型皮损为正常皮肤或红斑及风团基础上出现张力性水疱、大疱，体表任何部位均可受累，但常见于躯干和四肢，常伴瘙痒，有时有烧灼感，尼氏征通常阴性，黏膜受累不常见［2］。BP患者血清中产生针对皮肤基底膜带的循环自身抗体，靶抗原为BP抗原1（BPAg1，又称BP230，相对分子质量为230 000）和BP抗原2（BPAg2，又称BP180，相对分子质量为180 000），它们是位于半桥粒上的两个主要结构蛋白。目前研究认为，BP180在BP发病上起主要作用，其NC16a表位与BP病情活动度和严重程度相关［3］。BP病理变化为表皮下水疱，直接免疫荧光显示基底膜带有IgG和（或）C3沉积，行盐裂皮肤间接免疫荧光检查（indirect immunofluorescence on salt-split skin，IIFSSS）可发现免疫复合物沉积在表皮侧［4］。BP的诊断基于临床表现、病理和免疫学检测结果，目前少有对中国人群BP采用血清学诊断方法的大样本临床研究。基于此，我们分析IIF-SSS及BP180 NC16a酶联免疫吸附测定（ELISA）检测在BP诊断中的敏感性、特异性、相关性，从而更好地指导血清学诊断方法在BP的应用。

对象与方法

一、临床资料

2015年1月至2017年8月，中国医学科学院皮肤病医院初诊为BP患者174例，所有入选病例符合以下标准：①典型临床以皮肤红斑基础上紧张性水疱为主要表现，尼氏征阴性；②组织病理证实为表皮下水疱，真皮内有嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润；③患者正常皮肤DIF示基底膜带有IgG和（或）C3沉积；④IIF-SSS检查示免疫复合物［IgG和（或）C3］线状沉积在表皮侧；⑤行BP180抗体检测阳性（即＞9 U/ml）；其中BP诊断符合④⑤；或者符合①②③+［④或⑤］［4-6］。174例中男108例，女66例，年龄2～95岁，平均70.25岁，均在病情活动期抽取全血。对照组129例中男76例，女53例，年龄5～90岁，平均53.12岁；对照组中健康体检30例，天疱疮38例，湿疹21例，脓疱性银屑病7例，多形红斑7例，扁平苔藓4例，药疹4例，丘疹性荨麻疹5例，痒疹3例，单纯性大疱性表皮松解症4例，获得性大疱性表皮松解症2例，P200类天疱疮1例，红皮病2例，增殖性脓皮病1例。本研究通过中国医学科学院皮肤病医院医学伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书。

二、方法

1.IIF-SSS：取包皮切除术后新鲜正常人包皮皮肤，去除皮下脂肪，切成0.5 cm×0.5 cm，放入预冷的1 mol/L NaCl溶液中，4℃，连续、缓慢、匀速搅拌24～48 h，每24小时换液1次，至表皮微微皱起，OCT包埋，切成6 μm厚冰冻切片，制成底片，-80℃保存。制好的盐裂皮肤冰冻切片取出，PBS清洗5 min 2次，并用去离子水漂洗1次。用PBS 1∶10稀释受检血清，滴加30 μl稀释的血清至底片上，37℃湿盒内孵育切片30 min，PBS清洗5 min 3次，双蒸水漂洗1次，吹干后加入以1∶50稀释异硫氰酸荧光素标记羊抗人IgG及C3（FITC-IgG及C3购于北京中杉金桥生物技术有限公司），重复上述孵育、清洗、漂洗步骤，吹干后荧光显微镜（日本Nikon公司）下观察结果。以盐裂皮肤表皮侧或真皮侧见荧光沉积判断为阳性（图1）。

2.BP180 NC16a-ELISA和定量方法：严格按照BP180 NC16a-ELISA抗体检测试剂盒（日本MBL公司）说明书操作。将待测血清（1∶101稀释）及Calibrator 1和Calibrator 2各100 μl分别加入至抗原包被的微孔。室温（20～25℃）孵育1 h，洗涤4次；各孔加入100 μl结合液，室温孵育1 h，洗涤4次；各孔加入100 μl底物溶液，室温孵育30 min；各孔加入100 μl终止液终止酶反应。酶标仪（美国BioTek公司）A450 nm下读取每孔吸光度值，根据结果判定公式计算：Units（U/ml）=（A450＜Sample＞-A450＜Calibrator1＞）/（A450＜Calibrator2＞-A450＜Calibrator1＞）×100，每个样品做2个复孔，取均值。结果判定：抗BP180NC16a-ELISA值（U/ml）＜9为阴性；＞9为阳性。

图1 表皮下水疱病盐裂皮肤间接免疫荧光检测（箭头）1A：裂隙表皮侧可见荧光沉积；1B：裂隙表皮侧和真皮侧均可见荧光沉积；1C：裂隙真皮侧可见荧光沉积；1D：裂隙表皮侧和真皮侧未见荧光沉积

3.统计学方法：用统计软件SPSS 22进行分析。计量资料以±s表示，采用χ2检验及Fisher精确检验法。计量资料用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）及ROC曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）反映BP180 NC16a-ELISA法敏感性和特异性。用Spearman非参数双变量相关分析方法分析IIF-SSS与BP180 NC16a-ELISA法相关性。

结果

一、IIF-SSS与BP180 NC16a-ELISA敏感性及特异性比较

174例BP患者及129例对照IIF-SSS与BP180 NC16a-ELISA结果见表1。BP患者及对照者BP180 NC16a-ELISA值及BP180 NC16a-ELISA ROC曲线见图2。IIF-SSS敏感性为93.67%，特异性为100%，BP180 NC16a-ELISA的敏感性为96.55%，特异性为96.12%。BP180 NC16a-ELISA与IIF-SSF敏感性比较，P值0.214，差异无统计学意义。BP180 NC16a-ELISA与IIF-SSF特异性比较，P值为0.024，差异有统计学意义。BP180 NC16a-ELISA AUC值为0.978。

表1 大疱性类天疱疮（BP）患者组与对照组盐裂皮肤间接免疫荧光检查（IIF-SSS）与BP180 NC16a酶联免疫吸附测定（ELISA）结果比较

图2 大疱性类天疱疮（BP）患者组与对照组BP180 NC16a酶联免疫吸附测定（ELISA）值及BP180 NC16a-ELISA ROC曲线

二、IIF-SSS与BP180 NC16a-ELISA相关性分析

IIF-SSS与BP180 NC16a-ELISA法相关系数为0.147，P＜0.05，差异有统计学意义。相关系数＞0.7是强相关，0.4～0.7是中度相关，0.1～0.3是弱相关。

三、直接免疫荧光（DIF）、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性

从174例BP患者选取25例具有典型BP临床表现，尼氏征阴性，组织病理检查证实为表皮下疱，真皮内有嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润，并有DIF、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA检测结果。结果显示DIF敏感性为80%，IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性为96%，差异无统计学意义。

讨论

BP好发于70～80岁老年人，＜50岁的人群很少患BP，偶见于儿童，随着社会的老龄化及疱病血清学诊断的应用，BP患者人数呈上升趋势［7］。不典型BP可模拟多形红斑、出汗不良性湿疹、扁平苔藓、药疹、结节性痒疹、红皮病等疾病，此外BP还需与表皮内水疱病以及其他表皮下水疱病鉴别，为临床诊断带来了挑战［8］。研究认为，BP180在BP发病上起主要作用，BP180属于Ⅱ型跨膜蛋白，N末端位于细胞内，C末端位于细胞外，其细胞外肽链含有15个胶原样节段，故又称为ⅩⅦ胶原（COL17），BP患者血清学研究及BP动物模型、冰冻切片模型和细胞模型的相关研究表明，COL17的NC16a结构域是BP主要的致病靶抗原，Hofmann等［3］和Zhao等［9］通过酶联免疫吸附试验发现NC16a自身抗体与BP病情活动度和严重程度相关。BP病理变化为表皮下水疱，直接免疫荧光显示基底膜带有IgG和（或）C3沉积。BP的传统诊断基于临床表现、病理和DIF检测结果，基于此，我们对BP血清学诊断方法（IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA）进行相关分析并与DIF进行比较，从而更好地指导血清学诊断方法在BP的应用。

以往其他报道的IIF-SSS敏感性70%～85%，特异性96%～100%［10］，我们研究发现，IIF-SSS的敏感性为93.67%，特异性为100%，与之相比特异性一致，敏感性有所提高，说明IIF-SSS是BP诊断的重要标准。除BP以外，表皮侧IgG和（或）C3沉积还可见于瘢痕性类天疱疮，这种情况时靶抗原是表皮侧抗原BP180NC16a表位和α6β4整合素。然而瘢痕性类天疱疮靶抗原具有异质性，还包括真皮侧抗原BP180羧基端表位、层粘连蛋白5和Ⅶ型胶原。瘢痕性类天疱疮往往有多个抗原受累，因此多数IIFSSS为双侧沉积模式（IgG和/或C3同时沉积在表皮侧和真皮侧），有时还可表现为单独真皮侧沉积［11］。

BP180 NC16a-ELISA的敏感性为96.55%，特异性为96.12%，BP180 NC16a-ELISA的AUC值为0.978，说明BP180 NC16a-ELISA在BP诊断中具有较高价值。我们既往研究BP180 NC16a-ELISA特异性和敏感性均为97.62%［12］，与之相比，两次研究结果一致。为了更好地探讨血清学诊断方法在BP诊断中的价值，我们从174例BP患者选取25例具有典型BP临床表现，尼氏征阴性，组织病理检查证实为表皮下疱，真皮内有嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润，并有DIF、IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA检测结果，结果显示DIF敏感性为80%，IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA敏感性均为96%，BP血清学诊断方法（IIF-SSS，BP180NC16a-ELISA）的敏感性与DIF差异无统计学意义，说明血清学诊断方法和DIF均是BP诊断的重要方法。

IIF-SSS与BP180 NC16a-ELISA法相关性研究发现相关系数为0.147，P＜0.05，提示IIF-SSS与BP180 NC16a-ELISA法有相关性，但相关系数偏小。研究结果说明，IIF-SSS不仅与BP180自身抗体有关，可能还与BP230有关。既往研究发现，IIFSSS与BP180 NC16a-ELISA法无相关性，分析差异原因可能与IIF-SSS敏感性差异有关［1，12］。

BP血清学诊断方法特异性强、敏感性高，值得临床推广应用。BP血清学诊断我们推荐IIF-SSS和BP180 NC16a-ELISA法联合使用，原因如下：①IIFSSS荧光结果可作为BP诊断的重要标准，并通过抗体沉积模式对表皮下水疱病进一步分类诊断；②BP180 NC16a-ELISA法不仅能够为临床提供客观、定量、重复性好的数据，而且能够为病情评估提供参数。

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