苎麻微生物脱胶技术的研究进展

杨琦，段盛文，彭源德

（中国农业科学院麻类研究所，长沙410205）

苎麻（Boehmeria nivea）是荨麻科苎麻属作物，其韧皮的单纤维长、强度大、吸湿和散湿迅速、热传导性能优良，是纺织行业的重要原料。我国是苎麻的主要产地，产量约占全世界的90%以上，具有较大的经济效益和国际影响力。然而，苎麻原麻中含有30%左右由果胶和半纤维素组成的键合型非纤维素物质（俗称“胶质”），这些胶质的存在会影响苎麻纤维的质量，不能直接用于纺织［1］。脱胶是苎麻纤维用于纺织前的关键步骤，目前苎麻脱胶的方法有传统沤麻法、化学脱胶法和生物脱胶法。传统沤麻法污染大、耗时长，已不适应于工业化的生产。工业上常用的化学脱胶法高耗能、高污染，废水中COD含量高，且该方法中的酸和碱对苎麻纤维的损坏较大［2］，严重制约了苎麻纤维加工行业的发展，高效环保节能的生物脱胶方式则改变了这一现状。

苎麻生物脱胶有微生物脱胶和酶法脱胶两种。酶法脱胶中的生物酶大多来源于好氧微生物，酶制剂的生产环境苛刻，成本较高，限制了生物酶的应用和推广［3］；且由于苎麻胶质成分复杂，一种或几种生物酶的脱胶能力有限，其脱胶效果也不易控制。微生物脱胶则是以苎麻的胶质为主要培养基，在脱胶微生物的生长繁殖过程中实现苎麻纤维的分离，具有节约成本、提高精干麻质量、不损伤纤维和降低污染等优点［1］。因此，微生物脱胶法可作为实现苎麻韧皮中非纤维素物质剥离的优选方法来使用。本文对微生物脱胶的机制，以及近年来的研究现状进行了分析阐述，并展望了该领域未来的研究重点，以期为微生物脱胶技术在苎麻等草本纤维加工方面的应用发展提供参考。

1 微生物脱胶机制

微生物对苎麻韧皮的脱胶作用（见图1），其实质为脱胶菌种在以胶质为主要碳源的条件下进行生长繁殖，这一过程中所产生的胞外酶使得胶质被酶解成可溶于水的小分子糖［4－5］，从而实现苎麻的脱胶。所产生的小分子糖则进入微生物的菌体细胞内，参与新陈代谢过程，并提供菌体生长所需的能量，达到“胶养菌，菌产酶，酶脱胶”的目的［6］。脱胶菌株分泌降解胶质的胞外酶主要是果胶酶与半纤维素酶，其中木聚糖酶在半纤维素酶中所占比例最大，生物脱胶中酶法脱胶便建立在对脱胶菌株胞外酶研究的基础上。苎麻微生物脱胶的研究领域主要涉及3个方面：优良脱胶菌种（群）的分离选育、脱胶菌株发酵工艺的优化、以及脱胶工艺的优化。

图1 苎麻微生物脱胶的作用机制Fig.1 Mechanism and research fields ofmicrobial degumming in ramie

2 脱胶菌株（群）的分离选育

性能优良的脱胶菌种是微生物脱胶技术的基石，具有较强脱胶能力的微生物菌株来源大致有两种途径，分别为从自然环境中筛选野生型菌株以及在已有脱胶菌株的基础上构建工程菌。

2.1 脱胶菌株（群）的筛选

脱胶菌种的传统分离策略是以单一碳源苎麻粉作为筛选条件［7］，从苎麻种植地［8］、腐烂苎麻韧皮［9］、天然沤麻池［10］和苎麻脱胶工厂附近土壤［11］等环境中获得目标菌种。利用传统分离方法可获得微生物菌株的纯种，包括细菌和真菌等［9］。目前已报道的脱胶菌种中，细菌所占比例较大，其中大部分是芽孢杆菌属（Bacillus），有短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）［12］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［10，13］和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）［14］等。具有脱胶能力的真菌主要是曲霉菌属（Aspergillus），如黄曲霉（Aspergillus flavus）［15］和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）［16］等。生长繁殖迅速的细菌能有效缩短苎麻微生物脱胶的周期，是挖掘优良脱胶菌种的重要来源（见表1）。

表1 苎麻脱胶的常见微生物菌株Tab.1 Microbial strains for ramie degumming

研究［30］发现天然沤麻过程往往是多种微生物协同作用的结果，这引起了研究者对复合菌群在苎麻微生物脱胶过程中作用的重视。通过对温水沤麻过程、苎麻种植园以及腐烂苎麻样本中的微生物多样性进行分析，发现苎麻脱胶由多种微生物协同作用，包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、豆科根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、变铅青链霉菌（Streptomyces lividans），假单胞菌（Pseudomonas brassicacearum）、地衣芽孢杆菌（B．licheniformis）和短小芽孢杆菌（B．pumilus）等［30］。因此，构建具有高效脱胶能力的复合菌群，可以丰富苎麻微生物脱胶的方法［31］。研究苎麻脱胶共生菌群中的优势菌株［32］，分析其群落结构与功能，发现沤麻菌群中的8株可培养微生物中有4株蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus），其余为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）、厚壁菌门（Phylum Firmicutes）、假单胞菌（Pseudomonas）以及苏云金杆菌（B．thuringiensis）［33］，故可进一步改进菌群结构，以便提高脱胶效率，优化微生物复合菌群的脱胶工艺。

2.2 高效脱胶工程菌株的构建

由于野生型菌种的脱胶能力通常较低，不适用于工业化大规模生产，因此，构建高效的脱胶工程菌株可促进苎麻微生物脱胶的产业化发展。微生物菌种选育在生物脱胶中占有重要地位，是决定苎麻微生物脱胶是否具有工业化价值的关键［34］。目前，构建高效脱胶工程菌的途径主要有不定向诱变和基因定向改造两种。不定向诱变大多是通过紫外线、亚硝酸或硫酸二乙酯对菌株或原生质体进行选育［24，35］，诱变的方式有单因素诱变和复合诱变［25，36］。经过上述方法诱变选育的工程菌脱胶能力都有较大幅度的提高，对黑曲霉（A．niger）、地衣芽孢杆菌（B．licheniformis）等脱胶菌株进行诱变选育后（部分菌株信息见表1），所获得的工程菌其脱胶液中的果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶的酶活力均有一定程度的提高，纤维素酶活力有所降低，脱胶效果较出发菌株更优［35－37］。

利用遗传改造的方法定向构建高效脱胶工程菌株（部分可用于脱胶的工程菌株信息见表1），可以解决原始菌株中胞外酶系不全或脱胶关键酶活力不高的问题。如通过构建多顺反子质粒可实现多种生物脱胶酶（果胶酶、木聚糖酶等）的共表达，利用所获得的工程菌株pETpxm（91x）/DCE－01进行苎麻脱胶，与原始菌株DCE－01相比，失重率、还原糖和COD值的指标分别增加到22.5%、460 mg/mL和4.9，明显提高了苎麻的脱胶效率［26］。从枯草芽孢杆菌（B．subtilis）中克隆木聚糖酶基因，将木聚糖酶基因转化果胶酶产生菌黑曲霉菌株An1（A．nigerAn1）后获得的脱胶工程菌株，与原出发菌株相比，工程菌株的木聚糖酶活性提高2倍多，处理后苎麻的残胶率下降55.18%［27］。

2.3 脱胶生物酶（酶系）高产菌株及酶稳定性的研究

2.3.1 脱胶生物酶（酶系）的异源表达

采用基因工程的手段获得高产脱胶酶（酶系）的工程菌株，可实现脱胶酶基因的异源表达，以提高目标酶（酶系）的酶活力。将所获得的工程菌株发酵后，富含高活力脱胶酶的发酵液用于酶法脱胶。参与苎麻生物脱胶的酶有果胶酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等，其中果胶酶被认为是在脱胶过程中起主要作用的生物酶。目前，异源表达不同来源的果胶酶基因是提高果胶酶产量和活力的重要手段之一。为提高果胶酶产量，Liu等［19］将枯草芽孢杆菌TCCC11286（B．subtilis TCCC11286）中的果胶裂解酶在枯草芽孢杆菌 WB600（B．subtilisWB600）中进行表达，果胶酶活力达445 U/mg。Zhang等［38］在毕赤酵母（Pichia pastoris）中异源表达来自枯草芽孢杆菌168菌株（B．subtilis strain 168）的果胶酶基因，外泌的果胶酶活性达1320 U/mg。此外，中科院微生物所马延和课题组在提高果胶酶的酶活力方面做了大量工作，Zhou等［39］将嗜碱性地衣芽孢杆菌（B．licheniformis）中的果胶酶基因在大肠杆菌（Escherichia coli）内实现异源表达，在高密度培养的条件下，酶活力达1450.1 U/mL。Li等［40］将来源于类芽孢杆菌（Paenibacillussp.0602）的果胶酶基因在大肠杆菌（E．coli）中进行异源表达，酶活力达2467.4 U/mL。Zhou等［17］将克劳氏芽孢杆菌（B．clausii）中的碱性果胶酶基因在大肠杆菌（E．coli）中实现异源表达，重组BacPelA基因的工程菌，果胶酶活力最高达8378.2 U/mL。异源表达在提高木聚糖酶和甘露聚糖酶等脱胶酶酶活力的研究方面也发挥了较大的作用。Huang等［10］在大肠杆菌（E．coli）中异源表达了枯草芽孢杆菌B10（B．subtilisstrain B10）中的木聚糖酶基因，该酶的外泌率提高到22.4%。Jalal等［41］将枯草芽孢杆菌R5（B．subtilisstrain R5）中的木聚糖酶基因在大肠杆菌（E．coli）中异源表达，木聚糖酶的稳定性和酶活性均增强。Wang等［42］采用密码子优化的方式在毕赤酵母（P．pastoris）中表达耐碱耐热的甘露聚糖酶，酶活达493.8 IU/mg。

2.3.2 脱胶酶（酶系）稳定性的提高

此外，因为脱胶酶的稳定性是影响苎麻脱胶效果的重要因素，研究者也着立于通过基因工程手段提高酶的稳定性。Zhou等［43］分析了来源于类芽孢杆菌（Paenibacillussp.0602）的果胶裂解酶晶体结构，并对该酶进行改造，使得其最适温度从67.5℃降为60℃，更加适用于苎麻脱胶。Zhou等［18］优化了来源于枯草芽孢杆菌（Bacillussp.strain N16－5）的果胶裂解酶，提高了该酶在苎麻脱胶过程中的热稳定性。Liang等［44］将来源于短小芽孢杆菌（B．pumilus）的热稳定性高的果胶裂解酶，在大肠杆菌（E．coli）中异源表达，利用进化策略提高该脱胶酶的活性，采用定点突变和随机突变获得果胶裂解酶M3，该酶的耐热性和热稳定性较野生型酶显著提高。

3 菌株发酵工艺优化

理论上，脱胶菌株经适宜的发酵工艺进行培养后，将以更优的生理特性应用于苎麻脱胶，目前对脱胶菌株发酵工艺的研究较少。在发酵技术方面，Zou等［45］通过分批补料发酵的方式显著增加了枯草芽孢杆菌7－3－3（B．subtilis7－3－3）中的碱性果胶酶产量，果胶酶活力从最初的202.5 U/mL提高到743.5 U/mL。Basu等［46］研究了一种利用藻酸钙固定化培养脱胶菌株短小芽孢杆菌DKS1（B．pumilusDKS1）的方法，采用固定化培养的脱胶菌株果胶酶的产量和酶活力分别提高到18 g/L和38.5 U/mL，比液体培养条件下高出1.5倍，应用固定化培养模式下的B．pumilusDKS1进行苎麻微生物脱胶，失重率达23%，效果与化学脱胶几乎一致，且所获得的纤维韧性增加了8%～11%。在培养基配方优化方面，吕继良等［8］优化了脱胶优势菌株发酵培养基的初始pH值、发酵温度、发酵时间及接种量等条件，脱胶菌株在接种量为5%、pH值为7.5、温度为35℃、培养时间为36 h的条件下果胶酶活性达到305.62 U/mL，较优化前提高了1倍，但未检测该发酵条件下所获得的脱胶菌株在苎麻微生物脱胶时的能力。黄芙蓉等［47］利用正交试验对脱胶菌株曲霉MCZ2（Aspergillus sp.MCZ2）发酵产果胶酶和半纤维素酶的条件进行了优化，在最优条件下果胶酶活最高可达到135.5 U/mL，半纤维素酶活为318.8 U/mL，比在未优化条件下菌株产生的两种酶活性分别提高了35.1%和68%。

4 微生物脱胶工艺优化

苎麻微生物脱胶主要包括微生物脱胶工艺及微生物法与其他方法联合脱胶工艺。其中微生物脱胶有单一微生物菌种脱胶工艺和复合微生物脱胶工艺两类。联合脱胶工艺的研究侧重于微生物法与酶法联合脱胶以及微生物法与化学法联合脱胶等。

利用性能优良的单一微生物菌种进行苎麻脱胶的工艺研究相对较成熟，这可能与该工艺的可控性和可重复性较高有关。Liu等［28］分离到一株苎麻高效脱胶细菌果胶杆菌属CXJZU－120，并基于该菌株研发了一套适用于工业化生产的脱胶工艺，将活化的细菌发酵液喷洒在苎麻韧皮上，6 h内可完成脱胶，该工艺条件与工业上传统的化学脱胶方法相比，生产成本降低到20.5%，污染减少了80%以上，资源利用率提高了50%以上，显示出微生物脱胶的显著优越性。此外，微生物脱胶工艺对苎麻单纤维具有一定的积极影响，如脱胶菌株8－1在39℃、菌液量体积比1∶40、静置培养4 d后，苎麻胶质去除率达到25.94%，且苎麻单纤维强力比化学脱胶提高43.45%，更有利于纺织［48］。

然而，由于单一菌株中参与胶质降解的胞外酶种类不全或某一脱胶酶酶活力不高，会引起苎麻脱胶效果不佳。采用两种及以上不同的菌株（群）进行联合脱胶，可实现协同互补，提高苎麻脱胶的效率和质量［49－50］。不同类型脱胶菌株的接种比例是影响复合微生物脱胶效果的因素之一，研究者［1］将芽孢杆菌 B2（Bacillussp.B2）和曲霉 M2（Aspergillussp.M2）混合发酵，Bacillussp.B2和Aspergillussp.M2的种子液接种量分别为6%和11%，水料比为15∶1（mL/g），脱胶初始pH值为6，温度为35℃，脱胶时间为50 h，此条件下处理后的苎麻纤维脱胶率可达到31.9%。在进行混菌发酵的过程中，影响苎麻微生物脱胶效果的另一因素是不同脱胶菌种的接种顺序和接种时间。将3株脱胶菌B3、B5和M1按此顺序间隔12 h接种于含苎麻原麻的培养基中，35℃条件下脱胶60 h可使苎麻脱胶率达到29.9%［51］。因此，可将多种脱胶菌株制成脱胶菌液用于苎麻脱胶［52］，并以苎麻为唯一碳源和能源对复合菌群进行长期驯化，驯化后的微生物复合菌群脱胶周期明显缩短，纤维强度也逐渐提高［31］。

微生物脱胶可与其他方法联合应用于苎麻纤维的精制，如与酶法脱胶或化学脱胶等开展联合脱胶工艺研究。Wang等［42］研究了酶法脱胶与单一微生物菌种脱胶的联合工艺，在毕赤酵母（P．pastoris）中表达来源于嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）的甘露聚糖酶，采用发酵后的酶液与可分泌果胶酶和木聚糖酶的芽孢杆菌属细菌HG－28（Bacillussp.HG－28）对苎麻韧皮进行联合脱胶，发现脱胶效率明显优于仅由HG－28菌株（Bacillussp.HG－28）脱胶的方法。Zheng等［29］开发了一套复合微生物脱胶与酶法脱胶的联合脱胶工艺，先将由3株嗜碱性脱胶菌株枯草芽孢杆菌NT－39、NT－53和NT－76（Bacillussp.NT－39，NT－53 and NT－76）组成的复合微生物用于苎麻脱胶，发酵48 h后再采用酶法脱胶，5 h后可使苎麻纤维中的残胶率下降至9.4%，体现了微生物与酶联合脱胶的优越性。此外，也可采用微生物—化学联合脱胶降低苎麻纤维的残胶率。微生物—化学联合脱胶法比仅采用微生物脱胶法或化学脱胶法效率更高，残胶率可达2.04%以下，且微生物脱胶时采用混合菌种，可减少化学脱胶方法中的碱用量［53］。脱胶真菌黑曲霉An.6（A．nigerAn.6）以未经刮制的苎麻韧皮为主要碳源，以0.4%麸皮为附加碳源，0.5% （NH4）2SO4为氮源，0.05%MgSO4、0.05%KCl、0.1%K2HPO4、0.001%FeSO4为矿物源，36～40 h内可使残胶率下降至14.42%左右，后续需要用0.5%NaOH处理30 min使残胶率下降至1.33%，所获精干麻达到纺织工业生产要求［54］。

5 结语与展望

脱胶是苎麻纤维加工过程中最为基础、关键的粗加工工序，脱胶效果的优劣直接影响到苎麻纤维的质量。然而，目前苎麻纤维工业化脱胶中的化学脱胶方法耗水量大，对环境造成严重的污染［55］，寻求环保高效优质的苎麻脱胶方法已成为苎麻纺织产业的迫切需求。生物脱胶法可以克服化学脱胶法的缺陷［56］，其中，苎麻微生物脱胶法以胶质为主要碳源，在微生物生长繁殖的过程中实现苎麻纤维的剥离，可实现苎麻韧皮纤维的清洁化生产，为快速节能苎麻脱胶方法的发展提供新思路。

现有研究成果对于促进苎麻微生物脱胶方法的发展具有重大意义，目前可从以下4个方面进一步推动该项技术的应用与发展：一是筛选可应用于苎麻脱胶工业化生产的微生物菌株（群）；二是利用分子生物学技术构建高效脱胶的工程菌株；三是通过优化脱胶菌株（群）的发酵工艺促进苎麻快速脱胶；四是形成适用于大规模工业化生产的苎麻微生物脱胶工艺流程。

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