海兰褐蛋鸡Ⅰ群禽腺病毒与球虫混感的病例诊断

向大育，申红春

（恩施职业技术学院 445000）

2017年5月，恩施自治州某规模化鸡场45日龄左右的海兰褐蛋鸡群开始出现死亡，表现为零星死亡，随后死亡增加，日死亡率达2%，病鸡精神沉郁，食欲差，鸡冠苍白，排拉红色血便。采用双黄连口服液和地克珠利治疗，治疗效果不佳。该鸡场将患病蛋鸡送检恩施职业技术学院，剖检见心包积液严重，肝脏黄黑相间。肾脏肿大、苍白，有尿酸盐沉积，盲肠内充满血液。

根据该鸡群的发病史、临床症状和剖检变化，初步诊断疑似为球虫与禽腺病毒I群混合感染。为了进一步确诊，对送检患病蛋鸡进行了粪检、PCR检测和病毒分离等实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

病料来源于恩施某鸡场的患病鸡，无菌剖检采集肝脏、心包积液等组织，加入的无菌PBS溶液，研磨后，-20℃保存；粪便采集新鲜血便。

1.2 试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker、质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA凝胶回收试剂盒等材料购自上海生工工程股份有限公司（简称上海生工）。

1.3 仪器

PCR仪：伯乐生命医学产品(上海)有限公司；显微镜：奥林巴斯（中国）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 粪便虫卵检查

取患病鸡新鲜粪便适量，加入饱和食盐水50mL，搅拌后使用60目筛网过滤。将过滤液按照3000r/min离心10min，弃上清液，沉渣再加50mL饱和食盐水，静置25min，蘸取表层液体置于载玻片上，盖上盖玻片，镜检。

1.4.2 病毒的检测

无菌采集病死蛋鸡的心包积液和肝脏，并提取组织总DNA和总RNA。以其为模板，分别进行FAdV-Ⅰ的常规PCR和RTPCR扩增。

禽腺病毒特异性引物参照文献中Ⅰ亚群的禽腺病毒Hexon基因合成引物，扩增片段为500bp，上游引物F：5'-AATTTCGACCCCATGACGCGCCCAGG-3'，下游引物R：5'-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3'。

本实验检测引物均由上海生工合成。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后送上海生工测定基因序列。

2 结果

2.1 病鸡的眼观病变

患病蛋鸡心包积液严重，心包中可见到大量的淡黄色的清亮液体，肝脏肿大，出血，质地脆弱易破裂，表面凹凸不平，坏死灶和出血交替出现，呈现黄黑相间。肾脏肿大、苍白，有尿酸盐沉积，盲肠内充满血液。

2.2 粪便镜检结果

镜检可见一端稍尖，另一病料样品孔与心包中液体端钝圆呈现椭圆形或卵圆形的球虫卵囊。

2.3 病毒的检测及测序分析

PCR电泳试验结果见图1，从图中可以看出，本次试验病料样品与心包积液PCR扩增产物与预期扩增产物片段大小相符，试验扩增产物的条带处于508bp，基因测序结果与GenBank中的序列比对，并用DNAStar软件同源性分析，结果为，分离株与禽腺病毒I群序列同源性为96.5%，表明病料样品中含有禽腺病毒I群。

图1 PCR扩增结果M：DL1 000 DNA Marker；1：组织样品；2：心包积液；3：阳性对照；4：阴性对照

3 讨论

禽腺病毒I群主要引起鸡的包涵体肝炎、心包积水综合征的特异性病原体，其主要病变特征为心包中有淡黄色水样或胶冻样的积液，心脏松弛、柔软。肝脏呈现淡褐色和黄色，质地变脆，出现充血、肿胀，伴有局灶性坏死点和出血点[1]。根据鸡群的临床症状、发病和病变特点、PCR检测及目的基因测序结果，可以确诊该鸡群为FAdV-Ⅰ与球虫混合感染。

心包积液综合征首次发生于1987年的巴基斯坦安卡拉地区[2]，我国的相关心包积液综合征报道较少。自2015年以来我国河南、辽宁、吉林、山东、河北陆续出现类似的疾病，并且呈现普发态势，已经为严重危害养禽业发展的一种传染病[2]。当前有学者对湖北各地区鸡场中禽腺病毒I群感染进行报道，郭杰、罗玲分别从湖北省某鸡场中心包积液综合征病例中分离鉴定为禽腺病毒I群[3]；周伟、郑成分别从武汉周边发病鸡场中分离出禽腺病毒I群[4]；蔡宇威报道从仙桃市某发病鸡场分离出禽腺病毒I群[4]。而恩施自治州尚未见该病的报道，本次从恩施某鸡场的获得分离株与禽腺病毒I群序列同源性为96.5%，表明在恩施地区该疾病已经流行。

此外，文献报道禽腺病毒I群一个条件致病性病毒，广泛存在于家禽的呼吸道和消化道，其发病往往伴随着其他不良因素如通风不良、饲料霉菌毒素超标；或者其他疾病如IBD、CIAV、H9N2、NDV的发生。因此，在饲养过程中要注重家禽饲养管理，提高鸡体免疫功能，同时加强禽舍中的环境卫生，加强通风，合理消毒，并做好IBD、CIAV等疾病的免疫工作，减少心包积液综合征。在治疗过程中，使用卵黄抗体，并结合保肝护肾的药物进行治疗，减少家禽的死亡，降低养殖经济损失。