丹参酮ⅡA对HCY诱导增殖血管平滑肌细胞ERS相关基因免疫球蛋白重链结合蛋白表达的影响

韩芬

【摘要】 目的 探究丹参酮ⅡA对同型半胱氨酸（HCY）诱导增殖血管平滑肌细胞（VSMC）内质网应激（ERS）相关基因免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）表达的影响。方法 通过HCY诱导构建兔VSMC增殖模型， 给予瑞舒伐他汀或不同浓度的丹参酮ⅡA进行培养， 采用实时荧光定量PCR测定实验兔Bip mRNA基因表达。结果 模型组Bip mRNA表达（3.27±0.30）高于空白对照组（0.13±0.35）， 差异具有统计学意义（P<0.05）;丹参酮ⅡA组0.5 mg/L剂量的Bip mRNA表达（4.53±0.60）、1.0 mg/L剂量的Bip mRNA表达（12.71±0.27）、瑞舒伐他汀组Bip mRNA表达（8.80±0.21）均高于模型组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 丹参酮ⅡA对HCY诱导增殖VSMC ERS相关基因Bip表达具有明显作用。

【关键词】 丹参酮ⅡA;血管平滑肌细胞;同型半胱氨酸;免疫球蛋白重链结合蛋白

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.07.116

目前临床尚未阐述动脉粥样硬化（AS）的发生机制， 但普遍认为与血管内皮损伤、血小板粘附、纤维组织增生、平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）等因素相关， 其中动脉粥样硬化病变形成的关键环节为VSMC迁移、增殖、摄取低密度脂蛋白（LDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）转变成泡沫细胞[1， 2]。有效干预VSMC迁移、增殖对动脉粥样硬化程度的降低具有重要的临床意义。本文对丹参酮ⅡA对VSMC内质网应激（endoplasmicreticulumstress， ERS） 相关基因免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chains binding protein， Bip） 表達的影响进行分析， 旨在探究丹参酮ⅡA对动脉粥样硬化起到的药理作用， 为丹参酮ⅡA治疗心血管疾病的有效性提供依据， 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 细胞：兔主动脉VSMC（中国协和医科大学基础医学院细胞培养中心）。药品：丹参酮ⅡA对照品、瑞舒伐他汀、HCY分别来自（中国药品生物制品鉴定所， 批号200619 ）、（阿斯利康制药有限公司， 批号ER322）、（Sigma公司， 批号C-7352）。纯度均在98%及以上。仪器：7500 Fast Dx 实时定量PCR仪、Tgradient PCR 扩增仪、IX71-F22FL /PH型倒置相差荧光显微镜。试剂：实时定量试剂盒与总RNA 提取试剂（日本Takara公司） 。

1. 2 方法 首先制备细胞悬液， 即丹参酮ⅡA组、空白对照组、模型组、瑞舒伐他汀组， 以1×108/L密度对以上四组细胞进行稀释， 并接种在96孔培养板实施培养， 24 h 后分别对其中三组（丹参酮ⅡA组、瑞舒伐他汀组、模型组）加入1×10-4mol/L的HCY， 空白对照组仅加入等体积培养液。24 h后， 瑞舒伐他汀组加入终浓度10 μmol/L瑞舒伐他汀， 同时丹参酮ⅡA组分别加入终质量浓度0.5、1.0 mg/L丹参酮ⅡA， 培养48 h。引物设计：β-actin， 上游、下游分别为5'-CTACAATGAGCTGGTGTGG-3'、5'-AGCTCTTCTTCAGGGAGGA-3';Bip， 上游、下游分别为 5-TCT AGGTGAACGACCCCTAAC-3、5-GTTCTCTCAATTTTCTCCCAAC-3。从以上述每组提取细胞总RNA， 以逆转录方式合成cDNA。PCR反应体系、SYBR Green I Mixture分别为10、5 μl， 上下游引物均为0.25 μl， 模板cDNA、ddH2O、Rox分别为1、3.3、0.2 mol/L。反应条件如下： 95℃预变性10 min、95℃变性30 s、58℃退火与72℃延伸均为40 s， 总共45个循环， 各个样本RNA含量均依照各自β-actin含量进行标准化， 利用2-△△CT 法对Bip基因相对表达予以分析。

1. 3 观察指标 分析丹参酮ⅡA对VSMC ERS相关基因Bip表达的影响。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数± 标准差 （ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

模型组Bip mRNA表达（3.27±0.30）高于空白对照组（0.13±0.35）， 差异具有统计学意义（P<0.05）;丹参酮ⅡA组0.5 mg/L剂量的Bip mRNA表达（4.53±0.60）、1.0 mg/L剂量的Bip mRNA表达（12.71±0.27）、瑞舒伐他汀组Bip mRNA表达（8.80±0.21）均高于模型组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

随着大量临床实践研究的深入， 认定动脉粥样硬化形成的关键环节为血管内皮细胞损伤、血管壁炎症反应、VSMC增生与迁移等， 同时已证实血管壁组成细胞、细胞外基质、血液成分间的相互作用是导致动脉粥样硬化病变形成、VSMC增殖的关键环节[3-5]。加强保护内皮细胞、抑制VSMC过度增殖为当前预防动脉粥样硬化发生的有效途径。

HCY属于一个代谢中间产物， 已证实是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的独立危险因子， 决定着动脉粥样硬化病变严重程度[7]。研究发现， HCY对体外培养VSMC、动脉粥样硬化病灶内VSMC均起到促进增殖作用， 说明通过HCY诱导VSMC增殖会诱发动脉粥样硬化。而ERS指各种应激原通过诱发内质网腔中错误折叠或未折叠蛋白质堆积而激活未折叠蛋白反应（ unfolded protein response， UPR）、细胞凋亡信号通路。结果得出， HCY促进VSMC增殖的同时ERS相关基因表达量上升， 考虑HCY促进VSMC过度增殖过程中可能存在ERS的参与。

丹参化学成分分为分水溶性、脂溶性， 其中丹参酮ⅡA属于脂溶性， 具有舒张血管、降压、抗栓等作用， 常被临床用于治疗心血管疾病[8]。本文结果表明， 丹参酮ⅡA可有效通过抑制分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路而阻断VSMC DNA的合成、异常增殖等， 加上丹参酮ⅡA对CyclinD1、CDK4的表达具有良好的干预效果。丹参酮ⅡA有助于拮抗HCY 诱导VSMC 增殖， 充分体现出丹参酮ⅡA抗VSMC 增殖功效与其自身剂量存在密切联系， 加之丹参酮ⅡA组Bip基因高表达， 进一步表明ERS是抗动脉粥样硬化的一种重要机制[9， 10]。

综上所述， 丹参酮ⅡA对HCY诱导增殖VSMC ERS相关基因Bip表达的具有显著作用， 适用于动脉粥样硬化等血管疾病的治疗。

参考文献

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[收稿日期：2017-11-07]