Cd2+对无机磷细菌生长及溶磷作用的影响①

王玉书，刘 海,2，黄建国*



Cd2+对无机磷细菌生长及溶磷作用的影响①

王玉书1，刘 海1,2，黄建国1*

(1 西南大学资源环境学院，重庆 400716；2 贵州省农业科技信息研究所，贵阳 550006)

无机磷细菌(phosphorus solubilization bacteria, PSB)是重要的土壤有益微生物，它们将植物不能吸收的难溶性无机磷转化为有效磷，对土壤磷素供应十分重要。镉是污染土壤的常见重金属，研究Cd2+胁迫下PSB的生长和溶磷能力，可揭示镉污染对土壤无机磷转化供应的影响，为改善植物磷素供应提供有益信息。试验以重庆市缙云山国家森林公园毛竹林地分离的4株假单胞菌为供试菌株，比较它们的溶磷能力，研究了不同浓度Cd2+对PSB生长和溶磷作用的影响。结果表明：供试菌株溶磷能力PSB05>PSB09>PSB07>PSB01，溶磷指数和溶磷率最高值是最低值的2.08倍和4.14倍。摇瓶培养120 h后，培养液pH表现为PSB01 > PSB07 > PSB09 > PSB05，并与培养液中的无机磷含量()呈显著负相关(= –83.148 pH＋581.96，R＝0.9052，＝25)。在固体培养时，PSB05的溶磷圈和菌落直径随培养基中Cd2+浓度提高而降低。在Cd2+浓度0.5~2.0 mg/L液体培养基中，PSB05数量较无Cd2+对照减少22.09%~68.18%，草酸、乙酸、柠檬酸和氢离子分泌量显著下降，溶磷量降低5.27%~38.45%。供试菌株的溶磷能力差异显著；高浓度Cd2+抑制PSB05生长、有机酸和氢离子分泌及溶磷作用，不利于土壤供给磷素。

镉；无机磷细菌；溶磷

磷是植物必需的“三要素”之一，其重要性仅次于氮。土壤无机磷一般占全磷的50%~80%，并以难溶状态为主[1-2]。无机磷细菌(phosphorus solubilization bacteria, PSB)是重要的土壤有益微生物，它们将植物不能吸收的难溶性无机磷转化为有效磷，对土壤磷素供应和作物生长十分重要[3]。将PSB加入土壤，有效磷提高5.77~14.92 mg/kg[4]。PSB与过磷酸钙或钢渣磷肥混合施用，大豆吸磷量分别增加12.3% 和6.2%[5]。Chabot等[6]和Walpola等[7]发现，PSB促进西红柿、洋葱、马铃薯、香蕉、柑橘、咖啡、荞麦、苋菜和玉米等作物吸收磷素营养。Taurian等[8]从土壤中分离出59株PSB，均能不同程度地溶解难溶性磷酸盐，提高花生生物量，促进根系生长和根瘤形成。在PSB溶解无机磷酸盐的过程中，所分泌的有机酸和氢离子起重要作用[9]。

镉(Cd)是土壤污染的常见重金属之一，居12种全球危险性化学物质之首[10]。我国约有74% 的耕地缺磷，必须大量施用磷肥。26 a的定位试验表明，长期施用过磷酸钙使土壤Cd含量增加7倍[11]。在农业生产中，施用磷肥是造成土壤Cd污染的重要原因。Sheik等[12]和Chai等[13]分析了不同制革厂周边的土壤样品，发现重金属污染降低土壤细菌群落多样性，并分离出能快速溶解大量磷酸钙、磷矿石或磷酸铝等难溶性磷酸盐的sp. PSM11-5，其机理是分泌葡萄糖酸或柠檬酸等溶解磷。在Cd污染环境中，用内生真菌LK5接种野生型和脱落酸缺陷突变体的两种番茄植株，促进植物生长，提高叶绿素含量和气孔导度，以及根系磷含量[14]；将解磷菌株SJ-101施入镍污染土壤，显著增加芥菜生物量[15]；在砷污染土壤中，施用解磷菌株显著增加玉米根系长度[16]。因此，重金属污染土壤中可能存在抗性菌株。此外，Cd对土壤微生物产生多方面的危害，包括干扰新陈代谢，降低酶活性，破坏蛋白质和细胞结构，妨碍DNA复制与修复，抑制生长繁殖等[17]。土壤中栖息着106~109种微生物，具有不同的生理、生化和生态功能[18]。但是，目前关于Cd2+对PSB活化磷影响的认识还远远不够。

本研究以重庆市缙云山国家森林公园毛竹林地中分离的4株PSB为供试菌株，比较了它们的溶磷能力，并在培养液中添加不同浓度的Cd2+，研究了溶磷能力最强的菌株¾¾PSB05的生长及溶磷作用，旨在揭示Cd污染对土壤PSB生长和溶磷能力的影响，为改善树木磷素供应提供有益信息。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：PSB01、PSB05、PSB07和PSB09等4株PSB，属于变形菌门(Proteobacteria)，γ-变形菌纲(γ-Gammaproteobacteria)，假单胞菌目(Pseudomona­dales)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，假单胞菌属()，从重庆市缙云山国家森林公园毛竹林地(106º20' E，29º49' N，黄壤，pH 4.34)中分离获得，保存于西南大学资源环境学院微生物实验室。

培养基(g)：琼脂20，葡萄糖10，磷酸三钙2.5，(NH4)2SO40.5，NaCl 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，KCl 0.2，酵母膏0.5、MnSO4·4H2O和FeSO4·7H2O各0.002，蒸馏水 1 000 ml，pH 7.0~7.5，液体培养基不含琼脂，灭菌备用(121℃，30 min，下同)。

Cd2+溶液：用分析纯CdCl2·2.5H2O和无离子水配制 100 mg/L母液。

1.2 方法

1.2.1 PSB溶磷能力的测定 取供试PSB，接种于琼脂固体培养基，28℃恒温培养7 d，用游标卡尺十字交叉法测量培养后的菌落和溶磷圈直径，计算溶磷指数[19]：溶磷指数=(菌落直径+溶磷圈直径)/菌落直径。

同时，将PSB分别接种于液体培养基中，摇瓶培养48 h(28℃，100 r/min，下同)，稀释至细菌数102/ml。取1 ml接种于100 ml培养液中，对照为接等量的灭菌稀释液，重复5次，摇瓶培养120 h，离心10 min (4℃，10 000 r/min)。取上清液，用pHS-3C精密酸度计测定pH，钼蓝比色法测定无机磷含量[20]，并计算溶磷率[21]。溶磷率=[(接菌培养液磷含量–无菌培养液磷含量)×培养液体积/磷酸钙中的磷量]×100%。

1.2.2 Cd2+对PSB生长和溶磷能力影响的测定 国家《土壤环境质量标准》(GB15618—2015)规定，I ~ III类农业用地含Cd量不超过0.25 ~ 1.0 mg/kg。因此，利用CdCl2·2.5H2O母液配制Cd2+浓度(mg/L)分别为0(对照)、0.5(低)、1.0(中)和2.0(高)的液体培养基，各取100 ml于250 ml三角瓶中，灭菌、冷却，接种PSB05，摇瓶培养120 h，重复5次。

每隔12 h，用1.2.1中的方法测定培养液pH和无机磷浓度，计算溶磷量(即：培养液无机磷浓度×培养液体积)。培养结束后，用显微镜(XSP-6C，上海迪诺力泰公司)观测计数培养液中的PSB。然后，用0.1 mol/L H2SO4酸化培养液，高效液相色谱测定有机酸浓度。色谱条件为：Ion-300有机酸分析专用柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA)，进样量20 μl，流动相2.5 mmol/L 硫酸，流速0.5 ml/min，柱温35℃，压力 450 psi，Diode Array L-7455紫外检测器，检测波长210 nm。检测的有机酸包括草酸、柠檬酸和乙酸，其出峰时间(min)依次为9.15、10.51和14.91。

1.3 数据处理

分别用 Excel 2010和 SPSS 17.0 软件对试验数据进行基本计算和统计分析，LSD进行多重比较，显著水平为<0.05。

2 结果与分析

2.1 PSB的溶磷能力

从图1和表1可见，溶磷圈直径、溶磷指数、培养液水溶性无机磷浓度和溶磷率均以PSB05最大，PSB07和PSB09次之，PSB01最小，溶磷指数、培养液无机磷浓度、溶磷率3指标最高值是最低值的2.08倍、3.14倍和4.14倍。此外，在液培结束时，培养液pH表现为PSB01 > PSB07 > PSB09 > PSB05，并与培养液水溶性无机磷浓度()呈显著负相关(= –83.148pH+581.96，R=0.9052，=25)。

2.2 Cd2+ 对PSB05菌株生长的影响

考虑到PSB05溶磷能力最强，故以其为对象研究Cd2+对PSB05菌株生长和溶磷作用的影响。在固体培养时，Cd2+浓度越高，PSB05菌落直径越小，即Cd2+抑制生长的作用越强(图2)。在液体培养时，Cd2+对PSB05生长的影响类似固体培养，PSB05数量比无Cd2+对照减少22.09% ~ 68.18%(图3)。

图1 固体培养PSB的溶磷状况

表1 不同PSB菌株的溶磷能力

注:同列不同小写字母表示不同菌株间差异显著(<0.05)，下同。

图2 Cd2+对PSB05菌株生长的抑制作用

(图中不同小写字母表示处理间差异在<0.05水平显著)

图3 液体培养中Cd2+对PSB05菌株数量的影响

2.3 Cd2+ 对PSB05分泌有机酸和氢离子的影响

在PSB05的培养液中，分别检测到草酸、乙酸和柠檬酸。其中，柠檬酸浓度最高，乙酸次之，草酸最低 (表2)。低、中浓度Cd2+促进草酸分泌，提高培养液中的草酸浓度；高浓度Cd2+则产生抑制作用，草酸浓度比对照降低32.55%。随Cd2+浓度提高，培养液乙酸含量降低；在高Cd2+浓度的培养液中，乙酸含量比对照降低67.83%。与对照相比，低Cd2+促进柠檬酸分泌，培养液柠檬酸含量提高；中、高浓度Cd2+则产生抑制作用，降低培养液中的柠檬酸浓度。

由表2可见，与乙酸类似，随Cd2+浓度提高，培养液中的氢离子含量降低。在高Cd2+培养液中，氢离子含量比对照降低84.16%。

2.4 Cd2+对PSB05菌株溶磷量的影响

在固体培养基中加入Cd2+，不仅菌落直径降低，同时也减小溶磷圈直径(图2)。在液体培养基中，随培养时间延长，PSB05的溶磷量逐渐增加，可用对数方程=a·ln()＋b描述溶磷量()与培养时间()之间的关系(图4)。值得注意的是，Cd2+显著降低溶磷量，Cd2+浓度越高，降幅越大。液培120 h后，PSB05的溶磷量(mg/瓶)分别是19.17(对照)、18.16(低Cd2+)、15.99(中Cd2+)和11.80(高Cd2+)。

表2 PSB05菌株培养液中的有机酸和氢离子浓度

3 讨论

土壤有效磷对PSB的溶磷作用产生负反馈调节作用，低磷促进PSB溶解磷酸盐，高磷则产生抑制作用[22]。因此，在农业生产中，大量施用磷肥使PSB的效果欠佳。森林一般不施肥，主要依靠土壤供给磷素[23-24]，热带和亚热带森林土壤有效磷极低，故微生物活化土壤无机磷对于树木磷素供应十分重要[25]。

在培养液中加入Cd2+，PSB05数量成倍减少，说明Cd2+对PSB具有强烈毒性，类似Cd2+对固氮菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等生长繁殖的影响[26-27]。Cd2+与微生物DNA和RNA中的磷酸结合，抑制复制和转录或使碱基配对错误[26]；Cd2+与蛋白质分子中的羟基、氨基、巯基结合后，改变其空间结构与功能；Cd2+还能竞争或破坏酶活性位点，干扰土壤微生物的相关代谢[28-30]。因此，在培养条件下，外源Cd2+强烈抑制稻田土壤功能微生物¾¾厌氧固氮菌及产甲烷菌的生物活性，但抑制强度存在显著的种群差异[26]。谢晓梅[31]发现，Cd2+对土壤微生物具有广谱毒性，抑制细胞生长繁殖，减少种群数量，降低多样性。在Cd污染土壤中，可培养微生物总数大幅度减少，但不同种群的微生物对Cd2+的敏感性不一样，导致微生物种群结构改变[32]。Cd2+对明亮发光杆菌()的毒性强弱可能与细胞壁对Cd2+的亲和性密切相关，这是因为光合细菌的细胞壁含有羧基、羟基、醛基等带负电荷的基团，可吸附带正电荷Cd2+，故微生物细胞壁的负电荷越多，对Cd2+亲和性则越强，其毒性也越大[33-34]。因此，Cd2+可能干扰PSB05细胞分裂，妨碍新陈代谢，抑制生长或造成死亡。在Cd本底值较高或遭受Cd污染的森林土壤中，除Cd与磷酸盐结合(Ksp= 2.53×10–33)降低可溶性磷含量之外，还可能通过抑制PSB生长繁殖，妨碍溶磷，引起植物缺素。

图4 不同浓度Cd2+胁迫下PSB05菌株的溶磷量

PSB主要依赖于分泌低分子量的有机酸和氢离子活化土壤难溶性磷酸盐[35-36]。在PSB05培养液中，检测到柠檬酸、草酸和乙酸，柠檬酸与钙、铁、铝的络合(沉淀)常数(lg)分别为3.42、25.00、20.00；草酸与钙、铁、铝的依次是3.00、20.20、16.30，远高于相应钙、铁、铝等离子与磷的络合(沉淀)常数[37-39]。因此，PSB分泌的柠檬酸和草酸可溶解土壤难溶性钙、铁、铝磷酸盐，释放无机磷[40]。草酸和乙酸还是较强的有机酸，能电离大量的氢离子，直接溶解氟磷灰石、氯磷灰石、羟磷灰石等。供试4株PSB均能溶解磷酸三钙，培养液的pH与水溶性无机磷浓度呈线性负相关。有人从豆科植物根际分离出12种芽孢杆菌(sp.)，与假单胞菌(sp.)相似，均能分泌氢离子溶解磷酸钙[41-42]；伯克霍尔德菌(CC-A174)能分泌葡萄糖酸，电离出质子，溶解各类磷灰石[43]；在石灰性土壤中，青霉(和)能在NH4+存在时溶解磷酸盐，溶磷量与pH呈负相关[44-45]。因此，高Cd2+抑制PSB05分泌草酸、乙酸、柠檬酸和氢离子，这可能是固体培养溶磷圈减小和液体培养溶磷量降低的直接原因。

PSB合成与分泌有机酸的速率关系到培养液中的有机酸含量。在PSB05培养液中，高Cd2+降低有机酸浓度，意味着合成或分泌受到抑制。由于Cd2+降低三羧酸循环(TAC)多种酶的活性[46]，直接涉及柠檬酸和乙酸生物合成，它们同时也是草酸合成的直接(乙酸)和间接前体(柠檬酸)[47]。Cd2+抑制TAC酶活性可能降低PSB有机酸生物合成。此外，Cd2+与微生物DNA和RNA中的磷酸结合[26]，可能抑制有机酸合成酶基因组表达，减少相关酶的合成量。有机酸经细胞膜上的阴离子通道分泌进入培养液[48]，Cd2+对阴离子通道蛋白的变构作用抑制其活性，降低有机酸分泌速率。因此，Cd2+可能既抑制PSB有机酸合成又妨碍其分泌。但是，在Cd2+浓度较低时，促进PSB分泌草酸和柠檬酸，有益于螯(络)合Cd2+，减轻伤害，这种现象可视为保护性生理反应，也意味着PSB合成分泌有机酸对高低浓度的Cd2+有不同响应。

4 结论

4株假单胞菌的溶磷能力差异较大；高浓度Cd2+抑制PSB生长、有机酸和氢离子分泌及溶磷作用。研究不同菌株的溶磷作用及其对Cd2+的抗性有望获得高效优良的PSB，可用于Cd污染土壤的修复及改善。

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Effects of Cadmium on Growth and Phosphate Dissolving Abilities of Inorganic Phosphorus Bacteria

WANG Yushu1, LIU Hai1,2, HUANG Jianguo1*

(1 College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Guizhou Institute of Agricultural Science and Technology Information, Guiyang 550006, China)

Phosphorus (P) solubilization bacteria (PSB) is a group of important beneficial microbes which influence the ability of soil P supply due to the transformation of insoluble inorganic P unavailable for plants into available state. Cadmium (Cd) is a heavy metal commonly found in pollution soils. To study the growth and P dissolving ability of PSB under Cd2+stress could be helpful to further understand the effects of P transformation and supply in Cd polluted soils and to provide the beneficial information on the improvement of plant P nutrition. In this paper, 4 PSB strains ingenus isolated from moso bamboo () soil in Jinyun National Forest Park in Chongqing, were used to compare their P-dissolving abilities, and to study the changes in their growth and P solubilization in the culture mediums with Cd2+added in different concentrations. The results showed that P dissolving abilities changed in a sequence of PSB05 > PSB09 > PSB07 > PSB01. The highest P dissolving index and P dissolving rate were 2.08 times and 4.14 times than those of the lowest, respectively. After being shaken for 120 hours, pH of culture solution showed an order of PSB01 > PSB07 > PSB09 > PSB05, and a negative correlation was found between soluble inorganic P and pH value (soluble inorganic P =–83.148 pH＋581.96,2=0.9052,=25). The colony and P-dissolving-ring diameters of PBS05 strains grown on solid culture mediums were decreased with Cd2+concentrations increased. In liquid culture mediums with Cd2+0.5–2.0 mg /L, the number of PSB05 strains was reduced by 22.09%–68.18% compared with no Cd2+. Simultaneously, the efflux of oxalate, acetate, citrate and proton was inhibited by PSB05 strains, and the amount of inorganic P that dissolved from insoluble phosphates was reduced by 5.27%–38.45%. PSB strains tested in the present experiment varied significantly in P dissolving abilities. Cd2+inhibited microbial growth, organic acid and proton efflux and P solubilization at high concentrations, which is unbeneficial to P supply for in trees in forests.

Cadmium; Inorganic phosphorus bacteria; Soluble phosphorus

贵州省烟草公司遵义市公司科研项目(201503)资助。

(huang99@swu.edu.cn)

王玉书(1991—)，男，山西阳泉人，硕士研究生，主要研究方向为土壤微生物。E-mail: 969014327@qq.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.01.028

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