γ-聚谷氨酸研究进展

陈 勉，陈 磊，孙 康，张晓元，郝荣华，刘 飞, ，朱希强, ，凌沛学,

（1. 山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室，山东 济南 250101；2. 山东福瑞达医药集团公司，山东 济南 250101）

谷氨酸经γ-氨基连接成线型聚合物γ-聚谷氨酸 （poly-gamma-glutamate, PGA）。PGA在胞内以非核糖体依赖方式聚合，耐受蛋白酶水解，是不同于蛋白质的多聚肽类物质。生物PGA有助于微生物在胁迫环境生存，又助其逃避宿主免疫监视。PGA最早发现于炭疽杆菌（Bacillus anthracis）荚膜，也存在于纳豆（一种传统日本食物——发酵大豆）黏液，在哺乳动物体内发现与叶酸共价结合的PGA。PGA单体有D-、L-和DL-混合型，常见DL-混合型，该差异可由产生菌和培养条件不同引起。PGA的分子量、氨基酸组成、核磁共振波谱、红外光谱、二级结构等特征信息已有全面解析。PGA具可生物降解、可食用、无免疫原性、安全无毒等特性，已安全应用于食品、化妆品、药物载体及水处理等领域[1-4]。

本文通过查阅国内外相关资料，对PGA的研究进展进行综述，以冀为其进一步研究开发提供依据。

1 PGA在微生物、动物及人体内的表达

1.1 PGA在体表共生微生物中的表达

Fey等[5]的研究指出表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是一种生活在人体皮肤表面的共生菌，含高度保守的与PGA合成相关的capBCAD操纵子，能分泌PGA，保护菌体耐受高盐浓度，有助于菌体在人体皮肤表面存活。

Kocianova等[6]列举了含有与合成PGA相关的capBD基因并产PGA的表皮葡萄球菌，如Staphylococcus capitissubsp. capitis（ATCC27840），Staphylococcus capitissubsp. ureolyticus（ATCC 49324）及Staphylococcus caprae（ATCC 51548）等，及路邓葡萄球菌Staphylococcus lugdunensis（ATCC 43809）等。Zipperer等[7]研究了路邓葡萄球菌，该菌为人鼻腔中的一种能生产天然抗生素的共生菌，该菌也含PGA合成相关的capBCA操纵子[5,8]。

1.2 动物体内PGA表达

Ogunleye等[1]在鼠神经元中发现PGA与微管蛋白共价连接。Eddé等[9]的研究发现神经元中微管蛋白的高度异质性主要受控于翻译后修饰，即在谷氨酸残基的γ-羧基上连续加入谷氨酰单元的PGA化修饰。这种修饰发生在微管蛋白与微管相关蛋白及钙相互作用的重要区域内，可调节微管动力学行为。

Mcguire等[10]指出天然叶酸衍生物含2～8个谷氨酸残基连接而成的PGA化链。这些PGA化叶酸的通用功能包括：作为体内叶酸依赖性酶的辅因子；对某些不以PGA化叶酸为底物的叶酸依赖性酶具有抑制作用；对只结合了1个谷氨酸残基就被转运入胞内的叶酸衍生物，延长其在胞内的停留时间。不管是真核还是原核生物，以及叶酸衍生物中PGA长度如何，均由同一种叶酸-聚谷氨酸合成酶完成该叶酸的PGA化修饰。

具有抗叶酸作用的甘氨酰胺核糖核苷酸（glycamide ribonucleotide，GAR）甲酰转移酶抑制剂能在体内完成PGA化修饰。Habeck等[11]在维持标准饮食（SD）和低叶酸饮食（LFD）的荷瘤小鼠体内，比较两种经放射性标记的GAR甲酰转移酶抑制剂的分布，发现二者的肝脏和肾脏浓度最高。SD组小鼠肝脏中，两种抑制剂的PGA化图谱相似，可检测到最长聚合了6个谷氨酸残基的PGA化形式；LFD组小鼠肝脏中，168 h后还检测到聚合了多达7～8个谷氨酸的一种抑制剂的PGA化形式。

1.3 人体内PGA表达

人体也有逐步聚合谷氨酸成PGA链的能力。季晨博等[12]指出在人体内发挥作用的叶酸主要为PGA化叶酸。王玉等[13]指出虽然食物来源的叶酸也多以PGA化形式存在，但其在被人体吸收前预先由肠内结合酶去除其PGA化部分。盘瑶晖等[14]指出叶酸虽广泛分布于动植物食品中，但在动物和人摄入时，须被降解为游离叶酸后才能被机体吸收。人体吸收不含PGA的叶酸，而体内发挥作用的为PGA化叶酸，由此可见人体具有对叶酸（无PGA）逐步添加谷氨酸的PGA化修饰能力。

彭颖等[15]研究表明PGA是在人体细胞内合成的。研究发现临床上首选治疗类风湿关节炎的甲氨蝶呤（MTX）对20 %～40 %的患者无效。MTX的血浆浓度与疗效不相关，需在红细胞、滑膜细胞等细胞内转化为PGA化MTX才能发挥抗炎作用，并可通过检测红细胞内PGA化的MTX浓度来预测治效。Den等[16]持相同观点，并通过进一步的前瞻性研究，发现影响类风湿性关节炎患者细胞内PGA化MTX水平的更多因素。

人体内存在合成PGA片段的酶，如叶酰多聚谷氨酸合成酶（folypolyglutamate synthetase，FPGS），为体内叶酸的谷氨酸末端进一步延伸PGA链的合酶。Chen等[17]通过荧光原位杂交定位了FPGS基因在人类染色体的位置，分析了其基因组成，并分别通过原核、真核系统表达了人FPGS酶。研究还发现要达到胞内叶酸的累积，叶酸的PGA化长度需达到至少3个谷氨酸以上；受试样品中PGA化叶酸比单谷氨酸叶酸为底物时的催化效果更好。Lawrence等[18]还进一步研究了FPGS酶的胞内分布，发现人体线粒体内必需自备FPGS，因为胞浆中PGA化的叶酸无法穿过线粒体膜。

2 PGA降解酶

目前已发现多种来源的能降解PGA的酶。

2.1 噬菌体来源的酶

Kimura等[19]研究了噬菌体基因组编码的PGA水解酶。从生产纳豆的枯草芽孢杆菌宿主细胞中鉴定并纯化了来自噬菌体PhiNIT1的单体PGA降解酶（PghP）。PghP酶能内切PGA水解为寡肽，然后将其特异性转化为含3～5个谷氨酸的PGA盐。该酶催化机制可能与半胱氨酸残基、金属离子的参与有关。从噬菌体基因组中克隆并测序相应的pghP基因。该酶蛋白序列含208个氨基酸。

2.2 细菌来源的酶

Mamberti等[20]研究了产PGA的枯草芽孢杆菌基因组。找出与噬菌体PghP编码基因相似的数组基因，将其编码产物与PghP相比，确定这些基因存在于枯草芽孢杆菌基因组的原噬菌体元件中，其重组产物显示PGA降解活性。

Tian等[21]研究增强地衣芽孢杆菌WX-02中PGA降解酶的pgdS基因表达的作用。将该基因在大肠杆菌中异源表达PGA降解酶PgdS，该酶最适pH 5.5～6.5，最适温度37～45 ℃，Zn2+，Mn2+，Ca2+和SDS均能提高酶活，而Hg2+或Cu2+则抑制酶活性。γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）[1,22-23]、γ-谷氨酰基水解酶（PgsS）[1]、CapDPGA解聚酶等也具有降解PGA的活性[1]。

2.3 动植物组织内的酶

吴静等[24]研究了动、植物组织器官中广泛存在的胞外羧肽酶，一类专一性地从肽链的C末端逐个降解、释放游离氨基酸的肽链外切酶。其中羧肽酶G，又名谷氨酸羧肽酶（EC 3.4.17.11），作用于含有N-酰化底物C-末端，如PGA，释放谷氨酸，用于MTX的解毒及抗体导向酶-前药疗法。

3 血清PGA检测

Gates-Hollingsworth等[25]建立了兔血清中D-PGA的侧流免疫分析（lateral flow immunoassay，LFA）快速检测方法，检测限可低至1 ng/ml，平均检测时间为22±4.2 h。该方法中PGA的关键单克隆抗体8B10，是通过将合成的D-PGA寡聚体与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联，与适当佐剂一并皮下免疫CD1小鼠，再通过杂交瘤技术制得。

4 PGA免疫原性研究

Schneerson等[26]将天然及合成的D-PGA、牛血清白蛋白（BSA）及重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原（protective antigen，PA）或重组铜绿假单胞菌外毒素A（rEPA）结合构建免疫原。对5～6周龄小鼠进行3次免疫注射，考察其免疫原性。结果发现接合了D-PGA的D-PGA/BSA、D-PGA/rPA、D-PGA/rEPA免疫原大都在第2次免疫后产生数百EU的抗D-PGA抗体，第3次免疫后抗体数量再次剧增达数千EU；而天然D-PGA只显示痕量抗体水平，第3次免疫后可测抗体水平也仅低至4.4 EU。

Wyeth等[27]指出DL-PGA与载体蛋白偶联后能产生抗体反应，而单独PGA免疫原性微弱。Gonçalves等[3,28]推测之所以尚未发现PGA免疫原性，可能与其在体内可被降解为谷氨酸有关。

Ma等[29]研制了基于PGA/透明质酸的可注射水凝胶，用于控制蛋白质递送，显示良好生物相容性。Renò等[30]研制了含PGA的水凝胶复合材料，可增加人血浆蛋白和人角质细胞黏附量，具有良好的生物相容性和力学特征，有望用于软组织工程。

5 PGA在药品、化妆品领域中的应用

5.1 对抗肿瘤药物的修饰

周红艳等[31]研究指出MTX在体内FPGS的作用下可连接聚合度为2～6的谷氨酸链，形成PGA化MTX，再与叶酸竞争性结合二氢叶酸还原酶（DHFR），从而减少用于核酸和蛋白质合成的四氢叶酸生成而发挥抗肿瘤效应。在含有1～7个谷氨酸的PGA化MTX中，含4～6个谷氨酸的PGA化MTX对其抗肿瘤效应起主要作用。Allegra等[32]研究了单谷氨酸化MTX、PGA化MTX（含2～5个谷氨酸）对人MCF-7乳腺癌细胞胸苷酸合酶的抑制作用，PGA化MTX比单谷氨酸化MTX作用高75～300倍，对5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-单磷酸、叶酸辅因子和胸苷酸合酶的三元复合物形成的干扰程度则取决于叶酸的PGA化状态。

Bo等[33]将pH敏感PGA/壳聚糖水凝胶开发为靶向结肠的口服给药系统，观察到该水凝胶的细胞相容性处于可接受范围。Frank等[34]研究了负载有抗癌药物多柔比星（DOX）的PGA/壳聚糖纳米颗粒，体外研究证明该纳米颗粒对人口腔鳞状细胞癌细胞系（HN-5a）显示出细胞毒性。

5.2 对人骨髓间充质干细胞的作用

Antunes等[35]研究发现PGA促进人骨髓间充质干细胞（MSC）分化，促进细胞外基质（ECM）生成，因此添加PGA对未来软骨再生具有益影响。PGA对MSC、鼻软骨细胞（NC）细胞无细胞毒性。Schlegel等[36]的研究发现添加PGA能减少用于沉默体内基因的siRNA阳离子脂质体（siRNA-lipoplex）的体外及体内毒性。Gonçalves等[28]以PGA/壳聚糖聚电解质复合物作为趋化因子基质衍生因子-1（SDF-1）载体，可实现SDF-1在120 h内的连续释放，使人类MSC迁移增加6倍，达16.2±4.9个细胞/mm2，促进损伤组织修复。

5.3 临床研究

Park等[37]研究高分子量PGA对饮食诱导肥胖大鼠的肥胖症和脂质代谢的影响。经8周双盲安慰剂对照的临床研究，发现20名补充高分子量PGA（150 mg/d）的女性受试者总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇浓度有降低倾向，与动物实验结果一致。

Kim等[38]对99名健康志愿者进行随机双盲安慰剂对照临床研究，结果表明口服PGA可增加人自然杀伤细胞（NK细胞）活性，诱导细胞免疫。Sung等[39]发现口服PGA能促进Th1/Th17细胞分化，可在早期应用PGA防止Nc/Nga小鼠特应性皮炎发展。

Koo等[40]回顾性观察研究发现口服PGA可有助于高危HPV阳性阴道上皮内瘤变（VAIN）患者的细胞学变化消退和病毒载量降低，表明PGA有希望用于初级或持续性VAIN的治疗。

5.4 在化妆品领域中的应用

作为化妆品原料，PGA已被收录于《已使用化妆品原料名称目录》（2014年版）和《国际化妆品原料标准中文名称目录》（2010年版），广泛应用于化妆品领域，用作皮肤调理剂、保湿剂及头发调理剂等。

Isago 等[41]研制了由PGA和透明质酸经冷冻干燥制得的护肤品，用于化学去皮后护理。Bioleaders Corporation公司[42]研制了以PGA为活性成分的透明质酸酶抑制剂，能有效抑制降解皮肤真皮透明质酸的透明质酸酶，具有维持皮肤弹性、抑制炎性细胞渗透而缓解过敏的作用。

6 结论

已有研究表明PGA是生物体内固有成分，可被机体自行合成和降解。外源PGA未见明显免疫原性，血清中PGA已可被定量检测。研究还发现存在天然的PGA降解酶，可用于迅速清除PGA。PGA已在药品和化妆品领域广泛应用。上述研究报道将为PGA的进一步研究开发提供依据。