不同热剂量等级的微波消融治疗对结肠癌小鼠T细胞的影响

尚梦园，于峰，赵双双，吴新财，杜睿，陈宝定

（江苏大学附属医院超声医学科，江苏镇江212001）

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第3位［1］。近年来，结肠癌的发病率与病死率在我国呈上升趋势，达到甚至超过了西方发达国家的平均水平，其发病年龄在40岁以上，高发年龄普遍在50～60岁，比西方国家平均提早 10岁［2－3］。结肠癌患者发生肝转移的概率高达50%。研究认为，结肠癌发生肝转移的概率与结肠静脉血通过门静脉进入肝脏有密切关系。流行病学调查显示，随着年龄的增大，结肠癌肝转移的发生率越高，可能与年龄增大者机体免疫力下降有关［4］。

超声引导下的热消融治疗具有操作简单、安全、疗效好的优点，近年来已经成功应用于各类肿瘤的微创介入治疗［5－7］。微波消融属于热消融的一种。已有研究证实，微波消融治疗不仅能直接使肿瘤细胞凝固坏死，灭活肿瘤组织，而且还能提高患者免疫细胞数量及其抗肿瘤能力。但何种剂量等级既能有效杀伤肿瘤细胞又能最大限度地激发机体抗肿瘤免疫尚无研究，本实验比较不同热剂量等级的微波消融治疗对结肠癌小鼠T细胞的影响。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

1.1.1动物与瘤株 C57BL／6小鼠，6～8周龄，体重（20±2）g，购自江苏大学动物中心；MC38结肠癌细胞株由江苏大学生命科学研究所提供。

1.1.2试剂及设备 FITC标记的抗小鼠CD3抗体、PECy5标记的抗小鼠CD4抗体、PE标记的抗小鼠CD8抗体，相应同型对照均为Biolend公司产品；KY-2000微波消融治疗仪购于南京亿高微波电子研究所，微波频率为2 450 MHz，输出功率范围为5～20W且连续可调，微波电极针直径为1.2 mm；流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2　方法

1.2.1结肠癌荷瘤小鼠模型的建立 将在体外培养的对数生长期MC38细胞消化后制备成单细胞悬液，调整细胞密度为2×107／mL，用1 mL胰岛素注射器在C57BL／6小鼠的右前肢皮下接种0.1 mL，建立小鼠结肠癌皮下移植瘤模型。当小鼠荷瘤9 d，肿瘤体积长至约1 000 mm3时，认为模型制作成功。

1.2.2分组 肿瘤细胞接种9 d后，选取40只肿瘤体积约1 000 mm3的小鼠随机分为4组，每组10只。对照组不作任何处理，微波消融治疗分为低剂量组（5W、60 s），中剂量组（10W、60 s）和高剂量组（15 W、60 s）。

1.2.3微波消融荷瘤小鼠肿瘤 小鼠腹腔注射水合氯醛0.1 mL麻醉后，固定于自制小鼠手术台。常规消毒、铺巾，切开皮肤，沿肿瘤长径方向插入微波天线，接通微波消融治疗仪，对小鼠进行不同热剂量等级的微波消融治疗，根据不同分组调整能量输出，持续60 s（图1）。消融后皮下肿瘤原位留置，待小鼠从麻醉中苏醒后，送回动物实验室。

图1　高剂量组小鼠微波消融超声图

1.2.4观察小鼠肿瘤生长情况 于微波消融后的7 d、14 d时，经超声测量各组小鼠瘤体的体积。

1.2.5检测小鼠脾脏T细胞变化 微波消融后14 d，流式细胞术检测小鼠脾脏中的 CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T细胞。①标本采集：脱颈处死小鼠，切开腹部摘取脾脏，将脾脏放置于4℃预冷的PBS缓冲液中。②脾淋巴细胞分离：将脾脏置于筛网上，用5 mL注射器内芯研磨脾脏组织，而后用PBS缓冲液冲洗筛网，收集细胞悬液，室温下500×g离心10 min。弃上清液后加入红细胞裂解液2 mL，混合均匀，温室下放置10 min，500×g离心10 min。弃上清液，加PBS缓冲液2 mL，细胞混合均匀，调整细胞密度为106／mL。③ 流式细胞仪检测脾脏中T淋巴细胞。

1.3　统计学分析

2　结果

2.1　微波消融术后荷瘤小鼠肿瘤体积的变化

4组小鼠微波消融后第7天和第14天时，分别用超声测量肿瘤大小，结果显示，微波消融处理后小鼠肿瘤体积较对照组明显缩小（P＜0.05）。见表1。

表1　微波消融术后荷瘤小鼠肿瘤体积n＝10，mm3，±s

表1　微波消融术后荷瘤小鼠肿瘤体积n＝10，mm3，±s

组别　第7天　第14天对照组1 390±80.5　1 688±89.3低剂量组　988±40.8　837±72.8中剂量组　970±55.7　803±90.4高剂量组　623±79.2　525±65.7 F值16.342　18.227 P值　＜0.05　＜0.05

2.2　微波消融术后荷瘤小鼠T细胞检测结果

高、中、低剂量组的 CD3＋T、CD4＋T细胞均高于对照组（P＜0.05或 ＜0.01），且高剂量组明显高于中、低剂量组（P＜0.05）。高剂量组的CD4＋／CD8＋T细胞比值明显高于中、低剂量组（P＜0.05），且与对照组相比，增高显著（P＜0.01）。4组间的CD8＋T细胞不存在统计学差异（P＞0.05），见图2、表2。

图2　小鼠脾脏淋巴细胞流式细胞术检测结果

表2　小鼠脾脏中T淋巴细胞比例

3　讨论

本研究结果显示，微波消融术后，肿瘤体积减小；与对照组相比，各剂量组脾脏细胞中的CD3＋T、CD4＋T细胞和CD4＋／CD8＋T比值均增加，其中高剂量组显著增加。上述结果提示，微波消融后的小鼠免疫力有所提高。另外，本研究同时也显示，中、低剂量组的 CD3＋T、CD4＋T细胞和 CD4＋／CD8＋T比值并无明显差别，说明高剂量的微波消融治疗更加有利于提高小鼠的免疫力。

结肠癌好发于中老年人，可发生肝、肺转移，是威胁中老年人的重大疾病之一［8］。近年来，随着控温技术的不断改善，局部热消融治疗已成为继手术、放疗、化疗之后的又一重要治疗手段。局部热消融包括射频消融和微波消融［9］，相对于射频消融，微波消融有多个微波能量源，组织加热不受电阻和传导性的影响，而电磁波可以在更短的时间内使组织温度达到更高。近年来，微波消融技术提高了热效率，增加了消融体积，使得大肿瘤和富血供脏器肿瘤的治疗成为可能，拓展了该技术在临床肿瘤治疗应用的领域［10－11］。

“肿瘤微环境”理论认为肿瘤微环境的免疫状态能准确地反映宿主对肿瘤的免疫反应。许多研究都证实，热消融不仅能够对肿瘤细胞起到直接杀伤作用，还可从多个环节激发机体的免疫反应。Zerbini等［12］报道，消融产生的高温能使肝肿瘤组织发生凝固性坏死，大量坏死组织作为抗原能够产生持续性的局部炎症反应，活化抗原递呈细胞，诱导肿瘤特异性T淋巴细胞反应，改善机体抗肿瘤免疫耐受状态。抗肿瘤免疫应答主要以由细胞免疫为主［13－14］，其中T淋巴细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用，CD4＋T细胞主要介导肿瘤细胞对免疫系统的耐受，既可识别肿瘤细胞分泌的可溶性抗原，又可释放多种细胞因子参与抗瘤效应，共同发挥抗瘤作用。而CD8＋T细胞可以在促炎因子的作用下分化为细胞毒性T细胞，加强机体对肿瘤细胞的杀伤作用。CD4＋T和CD8＋T细胞相互诱导和制约形成T细胞网，保持一定的比值，对调节细胞免疫反应和维持免疫平衡有重要意义。CD4＋／CD8＋T比值的下降，表明机体细胞免疫状态受到肿瘤的抑制；比值上升，提示免疫功能的恢复或增强。本研究中，与对照组相比，微波消融各剂量组 CD3＋T、CD4＋T细胞和CD4＋／CD8＋T比值均不同程度地增加，测量所得小鼠肿瘤体积减小，说明小鼠免疫力提高。但四组间的CD8＋T细胞无显著性差异，提示小鼠免疫系统的杀伤功能没有明显增加。分析原因，可能与各种免疫细胞活化程度的不同或（和）肿瘤局部浸润的免疫细胞存在差异有关，其机制有待进一步研究。本研究结果显示，中、低剂量组 CD3＋T、CD4＋T细胞，CD4＋／CD8＋T比值无明显差别，分析原因：①低、中热剂量虽对肿瘤细胞造成了一定程度的损伤，但这种损伤可逆。② 体内热疗时，肿瘤组织内热剂量分布不均，可能导致一部分瘤组织仍存活。因此，低、中热剂量不足以对抗肿瘤负荷。

综上所述，本研究结果表明，微波消融治疗不仅是一种单纯的物理干预措施，更可以提高机体的免疫功能，改善免疫状态，控制肿瘤复发。且高剂量的微波消融治疗能更好地发挥抗肿瘤作用。

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