牡丹PoSAD基因克隆与表达分析

廖冰楠,陆俊杏,黄兴琳,管　丽,白辉扬,张　涛

(重庆师范大学 生命科学学院，重庆 401331)

凤丹牡丹(Paeoniaostii)隶属芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect.Moutan DC.)，是一种闻名世界的园艺和药用植物。牡丹作为世界上最古老的多年生开花植物之一，在中国有超过3 000年而在欧洲也至少有500年的历史。它除了具有独特的观赏价值外，还是不可多得的传统药材，更是一种新兴且经济效益较高的木本油料作物[1-3]。它不仅耐寒抗旱、适应力强，而且株型高大、结实率高，主要分布于四川、甘肃、陕西秦岭、河南洛阳、山东菏泽、安徽铜陵等地[4-6]。牡丹籽油富含人体不能自主合成的必需脂肪酸α-亚麻酸，它属ω-3 系列不饱和脂肪酸，是 DHA 和 EPA 的前体，具有促进大脑发育、预防神经和心脑血管疾病、降低血脂和抑制衰老等重要作用[7-9]。自 2011 年第 9 号卫生部公告公布以来，新资源食品牡丹籽油的开发利用引起各界人士的广泛关注，脂肪酸的相关研究成为热点[10]。

硬脂酰-ACP 脱氢酶(stearoyl-ACP desaturase，SAD)是高等植物脂肪酸合成代谢途径中的关键酶，催化硬脂酰ACP 在 C9 与 C10 之间引入一个双键形成油酰-ACP，在饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸的过程中起重要作用。从前人的研究中发现，SAD基因在向日葵[11]、菜豆[12]、芍药[13]、蓖麻[14]、大豆[15]和烟草[16]等植物中都已成功克隆，并有了较深入的功能研究。在木本植物油桐[17]、山茶花[18]、可可树[19]、澳洲坚果[20]和川桑[21]中也都已进行了SAD基因克隆分析和初步功能验证。对于凤丹牡丹，目前在分子水平上的研究甚少，凤丹牡丹SAD基因的研究未见报道。在脂肪酸组成成分和含量方面已有部分研究[5]，而凤丹牡丹籽中不饱和脂肪酸高含量以及相关脱氢酶基因的表达与不饱和脂肪酸积累的相互联系至今少有相关报道。

本研究对凤丹牡丹硬脂酰-ACP 脱氢酶PoSAD基因进行 RACE 克隆以及生物信息学分析，并采用实时荧光定量 PCR 技术对不同组织中PoSAD基因进行表达分析，分析多不饱和脂肪酸的积累模式，为PoSAD基因在不饱和脂肪酸生物合成过程中的调控作用奠定基础，为PoSAD基因的鉴定以及蛋白质的表达和功能验证提供依据。

1　材料和方法

1.1　材　料

凤丹牡丹(Paeoniaostii)种植于重庆师范大学牡丹园试验基地。试验于 2016 年 3～6 月在重庆师范大学细胞与遗传学实验室完成。分别取牡丹根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊和不同时期的种子，经液氮速冻后 -80 ℃保存，备用。

工程菌EscherichiacoliDH5α为细胞与遗传学实验室保存。PremixTaq酶、T4DNA 连接酶、DL2000 Marker、T/A 克隆载体 pGEM-T、逆转录试剂盒购于 TaKaRa 公司。EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒(DNase I)购于北京博迈德公司。荧光定量试剂盒购于成都百乐公司。

1.2　方　法

1.2.1引物设计和基因克隆从 NCBI 核酸数据库中查询获得 1 条牡丹 EST 序列信息，GenBank 登录号为 JI454401.1。分别设计 5′ 端和 3′ 端 RACE 引物，将获得的末端序列通过电子拼接得全长 cDNA 序列。采用软件 Primer Premier 5.0 设计基因特异性引物，5′ 端和 3′ 端 RACE 引物各2条，用于 RACE 第一次扩增和巢式扩增反应。反应引物：上游引物：PsSAD-GSP1、PsSAD-GSP2；下游引物：PsSAD-NGSP1、PsSAD-NGSP2(表1)。按照试剂盒使用说明提取总RNA 并反转录成 cDNA，利用设计的引物，以上述 cDNA 为模板，进行 RT-PCR 扩增，将扩增产物纯化、回收、连接克隆载体 pGEM-T，然后转化 DH5α，进行抗性筛选，PCR 鉴定后挑选单克隆送测序。引物及测序均由英潍捷基有限公司完成。

表1　PCR引物

1.2.2PoSAD基因cDNA序列生物信息学分析用 Vector NTI Advance 11 软件来进行序列比对、查找开放阅读框和翻译，SignalP4.1 server 分析信号肽，TMHMM Server v.2.0 分析跨膜区等。利用 Phyre2 在线分析蛋白质结构和结构域。利用 MEGA 7.0 软件采用邻接法对同源蛋白构建进化树。

1.2.3PoSAD基因组织特异性表达分析根据已克隆的凤丹PoSAD的 cDNA 分析结果，设计荧光定量引物，分别以根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊和不同时期种子的 cDNA 为模板，以PUF1639为内参基因[22]，反应引物：PUF1639 Forward、PUF1639 Reverse、PoSADForward、PoSADReverse(表1)。实时荧光定量 PCR 检测PoSAD在不同器官中的表达水平。RT-PCR 依照 SYBR®Premix Ex TaqTM II(TaKaRa公司)使用说明，在仪器 CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad公司)上进行。处理 3 个生物学重复，3 个技术重复，所得数据采用 Excel 进行平均数统计，以 SPASS 软件进行方差分析，绘制 RT-PCR 分析图。

2　结果与分析

2.1　PoSAD 基因全长 cDNA 的克隆

通过 RACE 法，以凤丹牡丹叶片 cDNA 为模板进行 PCR 扩增、TA 克隆和测序分析，获得 5′ 末端序列长度约 1 200 bp，获得 3′ 末端序列长度约 900 bp(图1)。经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果与预测大小一致。测序获得两末端片段后通过 NCBI 上 Blast 比对分析，确定了起始密码子 ATG 的位置，即PoSAD基因的 5′ 端，存在明显的 poly(A)加尾现象。然后进行电子拼接，成功从凤丹牡丹中克隆到全长PoSAD(GenBank 登录号为 KY038819)，经 Blastn 序列比对表明，克隆的PoSAD与蓖麻(Ricinuscommunis)SAD(NM-001323709.1)具有82% 相似性。 Vector NTI Advance 11 软件分析发现该基因全长序列共 1 559 bp，其中 5′ 非翻译区123 bp，3′端非翻译区共 172 bp，包含 1 197 bp完整开放阅读框。

方框标出起始密码子ATG；星号标出终止密码子TGA图1　PoSAD 核苷酸及推测的氨基酸序列图谱The initiation codon ATG is marked with box; The stop codon TGA is marked with asteriskFig.1　The sequence map of PoSAD nucleotide and putative amino acid

图2　PoSAD 保守结构域的预测结果Fig.2　Prediction of PoSAD conserved domains of P. ostii

图3　凤丹牡丹 SAD 与其他植物 SAD 蛋白的系统进化树Fig.3　Phylogenetic tree analysis of SAD of P. ostii and SADs of other plants

2.2　PoSAD 基因 cDNA 序列的生物信息学分析

SignaIP server 预测该蛋白无信号肽，TMHMM Server v.2.0 分析该蛋白无跨膜域。亚细胞定位软件 WoLF PSORT 预测 PoSAD 定位于内质网发挥功能。NetPhos2.0 预测它具有 25 个潜在的磷酸化位点，主要包括 14 个丝氨酸(Serine)、8 个苏氨酸(Threonine)和 3 个酪氨酸(Tyrosine)。由此推测 PoSAD 蛋白活性可能与其磷酸化调控有一定联系。利用 NCBI 在线分析工具 CDD 分析保守结构域(CD)，结果表明，PoSAD 属于 Ferritin-like 蛋白超家族(图2)。

2.3　PoSAD 蛋白质的进化分析

不同小写字母代表不同组织部位的差异显著性(P<0.05)图4　凤丹牡丹不同组织的 RT-PCR 分析Different normal letters show significant differences in different tissues(P<0.05)Fig.4　RT-PCR analysis of PoSAD expression in different tissues of P. ostii

从 NCBI 中查找到 11 种植物的 SAD 蛋白序列，采用 MEGA7.0 邻接法与凤丹牡丹 SAD 蛋白序列对比并建立无根系统进化树。凤丹牡丹与蓖麻(Ricinuscommunis)、烟草(Nicotianatabacum)、向日葵(Helianthusannuus)等 11 个高等植物的 SAD 蛋白序列比对显示，11 个植物SAD 氨基酸序列被聚为两大类，澳洲坚果、山茶花与烟草聚为一支；凤丹牡丹与蓖麻处于同一分支，其亲缘关系最近，其序列一致性为 81.0% ；与可可树、油桐、川桑等其他物种的 SAD 蛋白在进化上的亲缘关系较远(图3)，推测凤丹牡丹SAD基因的功能可能与蓖麻SAD基因功能相似。

2.4　PoSAD 基因组织特异性表达分析

不同小写字母代表种子不同时期的差异显著性(P<0.05)图5　凤丹牡丹种子不同时期的 RT-PCR 分析Different normal letters show significant differences in different growth stages(P<0.05)Fig.5　RT-PCR analysis of PoSAD expression in different growth stages of P. ostii seeds

实时荧光定量分析表明，从其组织特异性表达来看，PoSAD在不同器官中均有表达，在花瓣中的表达量最高，约为根的 8 倍，雌蕊和雄蕊表达次之，根中表达最低(图4)。其中，花瓣的表达量与根、茎、叶、雄蕊的表达量有显著性差异；表达量次之的雌蕊与根、茎、叶之间有显著性差异；低表达量的根与高表达量的花瓣、雌蕊和雄蕊之间也有显著性差异。在不同发育时期的种子中，表达量随着种子成熟逐渐呈上调趋势，其中成熟期种子 60 d 的表达量最高，80 d 次之，而幼种 10 d 表达最低(图5)。60 d 和 10 d 的表达量与另外4个时期的表达量均有显著性差异。

3　讨　论

本研究以凤丹牡丹为研究对象，在已知牡丹转录组测序的基础上，采用RACE扩增克隆获得PoSAD全长cDNA序列，通过同源比较发现所得目的片段与蓖麻相似性极高。序列分析表明，PoSAD同向日葵、油桐、川桑等 11 种高等植物SAD氨基酸序列相似性高达70%以上，它们都具有SAD的1 个保守结构域，同属 Ferritin-like 蛋白超家族，表明该结构域在分析进化过程中的稳定性较高，这可能与其在生长代谢中所具有的功能相关[23]。

氨基酸序列进化分析表明，凤丹牡丹 PoSAD 序列与蓖麻聚为一类，蓖麻同属油料植物，这说明序列相似的基因在进化时相对保守，在植物的脂肪酸合成中发挥相似的功能[24]。研究跨膜结构预测和亚细胞定位分析得知，PoSAD 蛋白无跨膜结构域，可能定位于叶绿体中发挥功能，预测该蛋白无信号肽，这将对研究 PoSAD 蛋白的相关功能提供参考。

研究发现，甘蓝型油菜硬脂酰-ACP 脱氢酶基因PoSAD在根、茎、叶、花蕾、花瓣、角果皮、雄蕊、柱头及种子中均能表达，且在花中的表达量最高,其次是叶片[25]。本研究中，虽然PoSAD在凤丹牡丹的组织器官中均能检测到表达，但其组织器官存在显著性差异，PoSAD在不同组织中表达结果显示，凤丹PoSAD在花瓣中表达量最高，雌蕊、雄蕊次之，根中表达最低。此现象表明该基因具有转录活性。在不同发育时期的种子中都有表达，授粉后 60 d 的表达量最高，表明授粉后种子中PoSAD迅速积累并发挥了脱氢酶的作用；随着种子逐渐成熟PoSAD表达量呈下调趋势，可能PoSAD的活性与底物硬脂酸含量的变化相关，说明本研究克隆得到的PoSAD可能在牡丹种子脂肪酸合成途径中发挥重要作用[26]。

研究PoSAD在凤丹牡丹中的组织特异性表达，分析多不饱和脂肪酸的积累模式，进而为研究脂肪酸生物合成的分子机理及代谢途径，利用基因工程手段来调控脂肪酸含量提供了理论依据，为深入探索该蛋白表达及其功能奠定基础。

参考文献:

[1]BERUTO M, CURIR P.InvitroCulture of Tree Peony through Axillary Budding [M]. Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits, Berlin：Springer Netherlands, 2007: 477-497.

[2]LI S S, WANG L S, SHU Q Y,etal. Fatty acid composition of developing tree peony (PaeoniasectionMoutan DC.) seeds and transcriptome analysis during seed development [J].BMCGenomics, 2015,16(1): 1-14.

[3]周琳,王雁. 我国油用牡丹开发利用现状及产业化发展对策[J]. 世界林业研究, 2014,27(1): 68-71.

ZHOU L, WANG Y. Development and utilization of oilseed peony and its industrial development strategy in China [J].WorldForestryResearch, 2014,27(1): 68-71.

[4]张涛,高天姝,白瑞英,等. 油用牡丹利用与研究进展[J]. 重庆师范大学学报(自然科学版), 2015, (2): 143-149.

ZHANG T, GAO T S, BAI R Y,etal. Utilization and research progress of oil tree peony [J].JournalofChongqingNormalUniversity(Natural Science), 2015, (2): 143-149.

[5]林萍,姚小华,曹永庆,等. 油用牡丹‘凤丹’果实性状及其脂肪酸组分的变异分析[J]. 经济林研究, 2015, (1): 67-72.

LIN P, YAO X H, CAO Y Q,etal. Variation analysis of fruit characteristics and fatty acid components inPaeoniaostii‘Phoenix White’ [J].NonwoodForestResearch, 2015, (1): 67-72.

[6]周志钦,潘开玉,洪德元. 牡丹组野生种间亲缘关系和栽培牡丹起源研究进展[J]. 园艺学报, 2003,30(6): 751-757.

ZHOU Z Q, PAN K Y, HONG D Y. Advance in studies on relationships among wild tree peony species and the origin of cultivated tree peonies [J].ActaHorticulturaeSinica, 2003,30(6): 751-757.

[7]KRISETHERTON P M, HARRIS W S, APPEL L J. Fish consumption, fish oil, omega-3 fatty acids, and cardiovascular disease [J].Circulation, 2003,23(2): 2 747-2 757.

[8]MAZZA M, POMPONI M, JANIRI L,etal. Omega-3 fatty acids and antioxidants in neurological and psychiatric diseases: An overview [J].ProgressinNeuro-PsychopharmacologyandBiologicalPsychiatry, 2007,31(1): 12-26.

[9] RUIZ-LOPEZ N, HASLAM R P, USHER S,etal. An alternative pathway for the effective production of the omega-3 long-chain polyunsaturates EPA and ETA in transgenic oilseeds [J].PlantBiotechnologyJournal, 2015,13(9): 1 264-1 275.

[10]中华人民共和国卫生部.公告2011年第9号[J]. 中国食品添加剂, 2011, (2): 264.

Announcement No. ninth, 2011, Ministry of health, People’s Republic of China [J].ChinaFoodAdditives, 2011, (2): 264.

[11]HONGTRAKUL V, SLABAUGH M B, KNAPP S J. DFLP, SSCP, and SSR markers for delta 9-stearoyl-acyl carrier protein desaturases strongly expressed in developing seeds of sunflower: intron lengths are polymorphic among elite inbred lines [J].MolecularBreeding, 1998,4(3): 195-203.

[12] AMELIA K, SINGH J, SHAH F H,etal. Analysis of common bean (PhaseolusvulgarisL. genotype BAT93) calmodulin cDNA using computational tools [J].PharmacognosyResearch, 2014,7(2): 209-212.

[13] ZHAO D, JIANG Y, NING C,etal. Transcriptome sequencing of a chimaera reveals coordinated expression of anthocyanin biosynthetic genes mediating yellow formation in herbaceous peony (PaeonialactifloraPall.) [J].BMCGenomics, 2014,15(1): 219-224.

[14] SCHMUTZ J, CANNON S B, SCHLUETER J,etal. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean [J].Nature, 2010,463(7278): 178-83.

[15] GNANASEKARAN T, KARCHER D, NIELSEN A Z,etal. Transfer of the cytochrome P450-dependent dhurrin pathway from sorghum bicolor intoNicotianatabacumchloroplasts for light-driven synthesis [J].JournalofExperimentalBotany, 2016,67(8): 2 495-2 506.

[16] RICHERO M, VEGA M B, CERDEIRAS M P,etal. Development of SCAR molecular markers for early and late differentiation ofEucalyptusglobulusssp.globulus, fromE.globulusssp.maidenii[J].Trees, 2013,27(1): 249-257.

[17] LONG H X, TAN X F, CHEN H,etal. Cloning and sequence analysis of full-length cDNAs encoding oleosins fromVerniciafordii[J].JournalofCentralSouthUniversityofForestry&Technology, 2010,30(4):31-38.

[18] WANG Z W, JIANG C, WEN Q,etal. Deep sequencing of theCamelliachekiangoleosatranscriptome revealed candidate genes for anthocyanin biosynthesis [J].Gene, 2014,538(1): 1-7.

[19] MORENOPÉREZ A J, SNCHEZGARCA A, SALAS J J,etal. Acyl-ACP thioesterases from macadamia (Macadamiatetraphylla) nuts: cloning, characterization and their impact on oil composition [J].PlantPhysiology&BiochemistryPpb, 2011,49(1): 82-87.

[20] HE N, ZHANG C, QI X,etal. Draft genome sequence of the mulberry treeMorusnotabilis[J].NatureCommunications, 2013,4(9): 2 445-2 445.

[21] MOTAMAYOR J C, MOCKAITIS K, SCHMUTZ J,etal. The genome sequence of the most widely cultivated cacao type and its use to identify candidate genes regulating pod color [J].GenomeBiology, 2013,14(6): r53.

[22]刘洪峰,高乐旋,胡永红. 牡丹不同发育阶段种子和花瓣组织实时荧光定量PCR中内参基因的挖掘与筛选[J]. 农业生物技术学报, 2015, 12: 1 639-1 648.

LIU H F, GAO L X, HU Y H. Reference genes discovery and selection for quantitative real-time PCR in tree peony seed and petal tissue of different development stages [J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 2015, 12: 1 639-1 648.

[23]王俊娟,穆敏,王帅,等. 棉花脱水素GhDHN1的克隆及其表达[J]. 中国农业科学, 2016, 15: 2 867-2 878.

WANG J J, MU M, WANG S,etal. Molecular clone and expression ofGhDHN1 gene in cotton (GossypiumhirsutumL.) [J].ScientiaAgriculturaSinica, 2016, 15: 2 867-2 878.

[24]戴鹏辉,任锐,曹福祥,等. 珙桐MYB转录因子DiMYB1基因的克隆及表达分析[J]. 植物生理学报, 2016,52(8): 1 255-1 262.

DAI P H, REN R, CAO F X,etal. Cloning and expression analysis of a gene encodingDiMYB1 transcription factor inDavidiainvolucrata[J].PlantPhysiologyJournal, 2016,52(8): 1 255-1 262.

[25]官玲亮. 红花(CarthamustinctoriusL.)不同组织多不饱和脂肪酸积累模式及调控机制[D]. 成都:四川农业大学, 2011.