KLF4及MMP2在膀胱癌组织中的表达及相互关系

卢湧湧 陶利萍 叶挺宇

[摘要] 目的 研究Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）及基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase 2，MMP2）在膀胱癌组织内的表达，分析两者间的相互关系，并探讨其可能机制及临床意义。 方法 收集2012年1月～2014年12月间115例膀胱癌患者的临床资料及肿瘤特征，采用免疫组化法检测膀胱癌组织内KLF4及MMP2的表达，分析两者之间的关系。 结果 KLF4在膀胱癌组织中表达显著降低，与患者年龄、肿瘤浸润深度、组织学类型、淋巴结转移显著相关，与性别、肿瘤大小、数目无关。进一步分析发现KLF4及MMP2在癌组织中的表达存在显著负相关。 结论 KLF4的低表达与膀胱癌的侵袭性增强密切相关，KLF4可能通过MMP2通路抑制了膀胱癌的侵袭性。

[关键词] 膀胱癌；侵袭性；KLF4；MMP2

[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）07-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of Krüppel-like factor 4（KLF4） and matrix metalloproteinase 2 （MMP2） in bladder cancer tissues， to analyze the correlations between the two， and to explore its possible mechanism and clinical significance. Methods The clinical data and tumor characteristics of 115 bladder cancer patients from January 2012 to December 2014 were collected. Immunohistochemistry was used to detect the expression of KLF4 and MMP2 in bladder cancer tissues. The correlations between the two were analyzed. Results The expression of KLF4 was significantly lower in bladder cancer tissues， significantly correlated with patient's age， tumor invasion depth， histological type， and lymph node metastasis， but not correlated with gender， tumor size and number. Further analysis found that there was significant negative correlation between the expression of KLF4 and MMP2 in cancer tissues. Conclusion The low expression of KLF4 is closely correlated to the enhanced invasiveness of bladder cancer. KLF4 may inhibit the invasiveness of bladder cancer through the MMP2 pathway.

[Key words] Bladder cancer； Invasiveness； KLF4； MMP2

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，术后复发率高，其中肌浸润性膀胱癌在接受了手术、放疗、化疗等综合治疗后，多数患者最终仍死于膀胱癌转移，因此研究膀胱癌的侵袭性是改善膀胱癌预后的关键[1，2]。Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是一种进化保守的核转录因子，在细胞的生长、增殖、分化等过程中起重要作用，KLF4与多种肿瘤相关[3]。因此我们研究KLF4及基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinase 2，MMP2）在膀胱癌组织内的表达，分析两者间的相互关系，并探讨其可能机制及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2012年1月～2014年12月间确诊的膀胱癌患者115例，年龄39～81岁，平均63.4岁，男85例，女30例。纳入标准：术后病理确诊为膀胱移行上皮癌。排除标准：①合并其他膀胱疾病史；②合并其他肿瘤病史；③合并其他可能影响研究结果的疾病。同时收集膀胱良性病变患者34例，年龄44～75岁，平均61.3岁，男32例，女12例，以膀胱远离病灶3 cm以上膀胱黏膜组织为正常膀胱黏膜对照组。两组间年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

將膀胱癌患者癌组织蜡块或正常膀胱黏膜组织蜡块打孔取样建立组织芯片，SP法免疫组化染色，IHS法半定量测定KLF4 及MMP2的表达情况。根据患者临床资料，确定肿瘤大小、数目、是否淋巴结转移，并按照国际抗癌联盟第7版TNM分期法进行分期，按WHO国际肿瘤组织学分类（2004）进行组织学分级。

SP法免疫组化染色具体流程：组织芯片蜡块进行切片（4 μm/片），常规脱蜡水化，胃蛋白酶溶液消化，EDTA抗原液修复，一抗孵育过夜（4℃），二抗（50 μL，带生物素标记）孵育20～30 min，加入卵白素后室温下孵育，确定显色适时终止。IHS法半定量分析：①染色强度，以多数细胞呈现的染色强弱计分（计为a）：无明显着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；②阳性细胞率，即5个视野（每400×高倍视野计数100个此类细胞）的阳性细胞的平均数（计为b）：1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；③a×b乘积为IHS评分，IHS评分≤3分为阴性，>3为阳性，其中≤6分为低表达，>6分为高表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件，两组間比较采用χ2检验，相关性检测采用Spearman相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织和正常膀胱黏膜组织中KLF4与MMP2的表达

115例膀胱癌患者中63例表达KLF4阴性（54.78%），52例表达KLF4阳性（45.22%），其中KLF4低表达41例（35.65%），高表达11例（9.57%）；34例正常膀胱黏膜组织中KLF4表达均阳性，其中KLF4低表达15例（44.12%），高表达19例（55.88%）。统计表明癌组织内KLF4的表达显著低于正常膀胱黏膜（P<0.001）。而115例膀胱癌患者中80例表达MMP2阳性（69.57%），其中MMP2低表达39例（33.91%），高表达41例（35.65%），MMP2阴性35例（30.43%）。34例正常膀胱黏膜组织中MMP2表达阴性21例（61.76%），阳性13例（38.24%），且都为MMP2低表达者。统计表明癌组织内MMP2的表达显著高于正常膀胱黏膜（P<0.01）。见表1。

2.2 KLF4、MMP2的表达与临床病理特征的关系

膀胱癌组织中KLF4的表达与患者年龄、肿瘤浸润深度、组织学类型、淋巴结转移显著相关，与患者性别、肿瘤大小、肿瘤数目无关。膀胱癌患者中年龄≥60岁、肿瘤浸润性高（T2～T4）、肿瘤分化程度低（高级别）、有淋巴结转移的患者，较年龄<60岁、肿瘤浸润性低（Ta～T1）、肿瘤分化程度高（低恶/低级别）、无淋巴结转移患者的KLF4表达低，具有显著性差异（P<0.05）。KLF4的表达与患者年龄、肿瘤的浸润深度、组织学类型、淋巴结转移之间的Spearman相关系数分别为-0.243、-0.268、-0.307、-0.250（P<0.05）。

膀胱癌组织中MMP2的表达与肿瘤浸润深度、组织学类型、淋巴结转移显著相关，与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数目无关。膀胱癌患者中肿瘤浸润性高（T2～T4）、肿瘤分化程度低（高级别）、有淋巴结转移的患者，较肿瘤浸润性低（Ta～T1）、肿瘤分化程度高（低恶/低级别）、无淋巴结转移患者的MMP2表达高，具有显著性差异（P<0.05）。MMP2的表达与肿瘤的浸润深度、组织学类型、淋巴结转移之间的Spearman相关系数分别为0.280、0.283、0.263。见表2。

2.3膀胱癌中KLF4与MMP2表达的相关性

在膀胱癌组织中，KLF4的阴性表达与MMP2的阳性表达之间存在高度巧合。63例KLF4表达阴性的患者中，34例有MMP2的高表达，17例MMP2低表达，仅有12例MMP2表达阴性。相关性分析发现，在膀胱癌患者癌组织中，KLF4与MMP2的表达之间存在显著负相关性，Spearman相关系数为-0.466（P<0.001）。见表3。

3讨论

KLF4亦称为胃肠富集Krüppel样因子（GKLF），是KLFs家族的重要成员，KLF4在多种器官与组织中表达，包括皮肤、睾丸、乳腺、膀胱等，且KLF4的表达与多种肿瘤相关[3]，在肺癌、食管癌、肝癌、肾癌、胃癌及结直肠癌中KLF4表达降低或缺失，KLF4起到抑制肿瘤的作用[4-8]，而在乳腺导管癌、头颈部及皮肤鳞状细胞癌中KLF4表达升高，KLF4起到促进肿瘤的作用[9-11]，这些研究表明KLF4既可作为致癌基因也可作为抑癌基因，其作用结果取决于其所调控的基因及其所在肿瘤细胞的染色质环境。

本研究检测了KLF4在膀胱癌组织中的表达，结果发现相对于正常膀胱黏膜组织，膀胱癌组织中的KLF4的表达显著降低，与李凡等[12]的研究检测膀胱癌组织内KLF4 mRNA的结果类似。本研究还进一步分析了KLF4表达量与膀胱癌临床特征的关系，我们的研究结果发现膀胱癌患者中年龄≥60岁、肿瘤浸润性高（T2～T4）、肿瘤分化程度低（高级别）、有淋巴结转移的患者KLF4表达显著降低，提示KLF4表达的降低与膀胱癌的侵袭性增强有关，与KLF4在肺癌、食管癌、肝癌、肾癌及胃肠道肿瘤中的表达情况类似[4-8]。在胃癌、结直肠癌及髓母细胞瘤中，启动子甲基化可导致KLF4表达降低[4，13-15]，而在肝癌、肺癌、肾细胞癌亦存在KLF4启动子的超甲基化现象[6-7]。通过甲基转移酶抑制剂抑制甲基化后，可恢复KLF4的表达，同时抑制结直肠癌和胃癌细胞系在体外和体内致瘤性[13，16][Restoration 27，38]，提示KLF4启动子的甲基化是KLF4表达降低的重要原因。另外，KLF4基因杂合性缺失（LOH）和位点突变也可能导致KLF4表达的降低[4，13-15]，但有关膀胱癌中KLF4表达的降低机制目前尚不明确，仍需要进一步研究。

MMP2是一种需要金属离子作为辅助因子的蛋白酶，能够降解基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原，使肿瘤细胞能够突破基底膜，最终形成转移灶[17]。MMP2与多种肿瘤包括膀胱癌密切相关，MMP2可以促进膀胱癌细胞的浸润和转移，MMP2高表达与膀胱癌的不良预后密切相关，因此MMP2在膀胱癌的侵袭中起着关键的作用[18，19]。在本研究中我们同时检测了MMP2的表达，结果表明在膀胱癌组织中，MMP2的高表达与膀胱癌侵袭性相关，并且MMP2的表达与KLF4的表达呈显著负相关。已有的研究显示，MMP2 启动子区域有多个KLF4结合位点，KLF4 可以通过直接结合MMP2的启动子区域，抑制其活性，降低其mRNA及蛋白的表达[20，21]。另外，KLF4 能够抑制EMT相关转录因子Snail 等表达，而后者能够显著增加MMP2的表达，提示KLF4 能够间接抑制MMP2的表达[22-23]。因此，我们推测KLF4通过直接或间接的方式抑制MMP2的转录从而抑制了膀胱癌细胞的侵袭性，但仍需要进一步研究证实。

總之，我们的研究发现膀胱癌组织中KLF4的表达降低，并与膀胱癌的侵袭性增强有关，与癌组织中MMP2的表达成负相关，KLF4通过可能抑制MMP2的转录从而抑制了膀胱癌细胞的侵袭性，KLF4可能是明确膀胱癌侵袭性的潜在生物学指标。

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（收稿日期：2017-12-21）