致奶牛乳房炎大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

高建鹏，张子荣，张奇波，杨 武，齐亚银*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；2.第六师五家渠市畜牧兽医工作站，新疆 五家渠 931300；3.新疆克拉玛依绿成农业开发有限公司，新疆 克拉玛依 834000)

奶牛乳房炎又称奶牛乳腺炎，主要是由于奶牛乳腺受微生物、物理、化学和环境等因素刺激从而产生的一类炎症反应。奶牛乳房炎是奶牛养殖业常见的一种临床疾病，引起乳房炎的微生物种类有很多,如细菌、病毒、真菌、支原体等,人们己从乳房炎的乳汁中分离到了130多种微生物,较常见的有20多种,以细菌感染比较多见,其中大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌具有国际广泛性,是引发乳房炎的主要致病菌,也有少数病原菌如大肠杆菌、化脓棒状杆菌、蜡样芽抱杆菌、绿脓杆菌等也可引起地方性流行。此外有人发现，乳粉抱霉、马红球菌、粪产碱杆菌、克柔氏念珠菌、粘质沙雷氏菌等一些国内外未见报道的病原微生物也可引起奶牛乳房炎。

大肠杆菌一直被认为是环境致病菌,但是近年来有人提出将其列为传染性致病菌。大肠杆菌具有很多毒力因子,其中LSP是大肠杆菌主要的致病毒力因子,能够引起动物机体急性炎症过程。奶牛发生大肠杆菌性乳房炎时,多为急性炎症过程,机体过度的炎症反应造成了乳腺上皮细胞的损伤、脱落,从而降低了产奶量,甚至会引起奶牛乳区的萎缩、坏死而丧失生产性能并可能诱发败血症,导致急性死亡。给奶牛养殖带来巨大的经济损失。

2016年9月，新疆北疆地区某规模化牛场的部分奶牛发生了以乳房炎为主要特征的病例，患牛体温升高、精神沉郁、食欲不佳。乳房触摸有硬块，乳房或乳头肿胀，乳汁中有絮片、凝块，部分乳汁为血乳，乳汁颜色发黄或发红，产奶量减少或无奶。为查明导致该病发生的主要致病菌，提供一套治疗方案，本研究对患乳房炎的奶牛进行了病原菌的分离和鉴定，为筛选敏感药物及科学防治奶牛乳房炎提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 新疆石河子某发病牛场的临床性乳房炎奶样两份。

1.1.2 培养基与生化试剂 LB肉汤、普通琼脂培养基、麦康凯培养基等各种生化试验用培养基参照文献[1]配置，4℃冰箱保存备用；革兰氏染液购自于贝索生物科技有限公司；细菌微量发酵管购自于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.1.3 主要器械 超净工作台(0066)，上海鸿都电子科技有限公司产品；全自动恒温振荡培养箱(ZHWY-2102C)，(上海智城分析仪器制造有限公司)；隔水式恒温培养箱(GH-600BC)，北京市永光明医疗仪器厂产品；4℃冰箱(BCD-209 S/D)，海信容声冰箱有限公司产品；立式电热压力蒸汽灭菌锅(HVE-50/HV-25，HIRAYAMA)及实验室常用大小试管及平皿。

1.1.4 药敏试验 氨苄西林(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、恩诺沙星(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、青霉素(10U/片)、链霉素(10 μg/片)、四环素(30 μg/片)、克林霉素(2 μg/片)、庆大霉素(10 μg/片)、头孢唑啉(30 μg/片)、呋喃妥因(300 μg/片)等药敏纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 染色镜检 将奶样涂片进行革兰氏染色，镜检观察细菌染色特性及形态特征。

1.2.2 分离培养 将乳样摇匀后，取100 ul接种于LB肉汤中，置37℃摇床内振荡扩增培养18～24 h后染色镜检，将扩增后肉汤中的细菌分别在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上划线培养，然后置37℃温箱内培养18～24 h后挑取典型的红色单个菌落染色镜检，观察菌体形态及染色特性，后再次接种到伊红美蓝培养基中培养，18～24 h后观察细菌形态，染色镜检对其鉴定，最后将已纯化的细菌进行保存。

1.2.3 生化鉴定 分离菌的生化鉴定，参照文献[2-3]的方法进行。将已分离纯化的菌株进行M.R、V-P、三糖铁、柠檬酸钠、吲哚、甘露醇、棉子糖、山梨醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖等生化试验，观察其生化反应特性。

1.2.4 药敏试验 采用K-B纸片扩散法进行药敏试验，参照赵占峰等[4]根据NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)标准判定试验结果。将纯化菌株在37 ℃营养肉汤中培养18～24 h，用无菌生理盐水将菌液稀释至浓度约为2×106个/mL，用无菌棉拭子蘸取菌液，均匀涂布于营养琼脂平板。每个平板贴6张药敏纸片为宜，两纸片相距25 mm，纸片与平板边缘10 mm～15 mm，并轻按纸片中心，使其附着严密，37 ℃恒温培养18～24 h。测量抑菌圈直径，判定分离菌株对药敏纸片的敏感性。

2 结果及分析

2.1 形态特征及培养特性

在37℃恒温培养箱中经24 h培养观察发现，分离菌菌落在普通琼脂培养基上呈灰白色、表面湿润光滑、不透明、圆形的菌落；在麦康凯培养基上呈鲜桃红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，符合大肠杆菌特性(图1)；挑选符合大肠杆菌生长特性的菌落，革兰氏染色镜检，在显微镜下发现两端钝圆的淡红色短状杆菌(图2)；在伊红美蓝培养基上形成圆形、隆起、光滑且具有金属光泽的菌落(图3)。结果发现，从两份奶样中两株疑似大肠杆菌。

图1 分离菌麦康凯培养基上生长状况

图2 显微镜镜检结果

图3 分离菌伊红美蓝培

2.2 生化鉴定结果

生化结果显示，两株分离菌的M.R反应都变为红色为阳性；V-P反应不变色为阴性；吲哚反应变为红色为阳性；柠檬酸钠反应不变色为阴性；三糖铁斜面能产气、产酸，不生成H2S；能发酵乳糖、葡萄糖、麦芽糖、棉子糖、山梨醇和甘露醇,不同的是一株可以分解蔗糖，另一株不能分解蔗糖。该试验结果符合大肠杆菌的生化鉴定，生化特性鉴定结果见表1和表2。

表1 分离株1的生化反应结果

注：“+”为产酸/阳性；“-”为不产酸不产气/阴性。

表2 分离株2的生化反应结果

注：“+”为产酸/阳性；“-”为不产酸不产气/阴性。

2.3 药敏试验

对分离培养获得的纯化菌株进行药敏试验,结果显示，分离菌株对氨苄西林和头孢唑啉高度敏感；对氧氟沙星、恩诺沙星、克林霉素、庆大霉素、呋喃妥因中度敏感；对青霉素、阿莫西林、链霉素、四环素耐受。试验结果见表3。

3 讨论

本试验从采集的乳样中分离出两株细菌，通过分离培养结果、形态学观察、生化特性分析对其进行鉴定，结果表明，分离菌株为大肠杆菌。

随着抗生素对细菌的选择压力越来越大，许多大肠杆菌对常用抗菌药物的敏感性日益降低，耐药菌株越来越多，各地所分离的大肠杆菌对抗生素的差异很大，目前很难确定一个能普遍使用的抗菌药物敏感谱[5]。方光远[6]等(2010)从南京某规模化牛场临床性乳房炎患牛分离出的大肠杆菌对头孢类抗生素高度敏感与本实验分离的大肠杆菌耐药性基本相同，而对庆大霉素、链霉素低度敏感，与本实验分离的大肠杆菌的耐药性有一定差异；朱少奇等[7](2011)从黑龙江黑河市周边地区临床型乳房炎分离出的大肠杆菌对青霉素与链霉素耐药，此结果与本实验大肠杆菌耐药性高度一致。说明大肠杆菌早已对此类抗生素产生了严重的耐药性；刘通等[8](2016)对黑龙江某规模化牛场致乳房炎大肠杆菌进行药敏试验，对四环素高度敏感的结果与本实验结果有很大差异。对于新疆，不同地域分离到的大肠杆菌耐药性也会有所不同。覃杰等[9](2014)对新疆铁门关地区(南疆)奶牛乳房炎大肠杆菌进行药敏试验，结果显示大肠杆菌对克林霉素高度敏感，对氨苄西林耐药，这与本试验大肠杆菌耐药性有所不同；贾林军等[10](2014)对新疆昌吉地区(北疆)致奶牛乳房炎大肠杆菌进行药敏试验，显示大肠杆菌对青霉素、庆大霉素、氨节西林中度敏感，此结果与本实验药敏结果有差异。

表3 分离株药敏试验结果

从药敏试验结果看，分离菌株对常规抗生素如阿莫西林、青霉素、链霉素等均产生较强的耐药性，其可能是由于该奶牛场长期使用上述常规抗生素或此菌株由牛场外传入引起奶牛发病，在传入之前已经对上述常规抗生素产生耐药性。因此在治疗奶牛乳房炎大肠杆菌感染时，最好选用经抗生素敏感试验确证为高效的药物用于治疗才能收到良好的效果[11]。建议牛场在防治大肠杆菌病时，对菌株进行药敏试验，根据试验结果用2-3种敏感药物按疗程和足够的剂量交替使用。

奶牛的饲养管理、牛舍及周围环境、工作人员的操作以及挤奶器械消毒等环节的问题都将会导致奶牛乳房炎的发生。我们在采样中发现，该牛场选址离公路较近，在泌乳牛舍中刺鼻气味重，捕蝇笼与粪污清理不及时，圈舍外粪便堆积地点和圈舍距离过近，这些因素都极有可能导致牛场奶牛乳房炎的发生。因此应加强奶牛的饲养管理，改善牛舍及周围环境卫生，保持牛舍通风干燥且定期清洗牛舍和对牛舍进行灭菌消毒。此外要定期对奶牛进行检查，对久治不愈的临床型乳房炎患牛应淘汰[12]。同时应规范挤奶程序，做好挤奶用具的消毒工作，防止挤奶过程中的微生物感染。

参考文献:

[1] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001．

[2] 王建永,张磊,赵月兰,等.腹泻犊牛病原分离鉴定及药敏实验[J].动物医学进展，2010，31(5):118-121

[3] Metter K B,Lisbeth N P,Jens K M.Eight-plex PCR and liquidarray ditection of bacterial and viral pathogens in cerebrospinal fluid from patients with suspectedmemingitis[J].JClinMicrobiol,2009,47(4):908-913

[4] 赵战峰,宋军科,于三科.奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定[J].动物医学进展,2010,31(4):113-115.

[5] 王志远，宋冶萍.青岛市奶牛乳房炎的病原分离与鉴定[J].畜牧与兽医,2002,34(7):31.

[6] 方光远,秦和春,顾亚凤,晏文梅,张志成,杜改梅. 奶牛临床型乳房炎大肠杆菌的分离与鉴定[J]. 中国奶牛,2010,28(09):34-36.

[7] 朱少奇,乔洁. 黑龙江省黑河市周边地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 中国乳业,2011,10(09):38-40.

[8] 刘通,刘宇,赵静虎,王华欣,周金玲,岳山,何泊宁,刘珊珊,张世勋,王天,刘增禄,朱战波. 黑龙江某规模化场奶牛急性乳房炎病原分离鉴定与药敏实验[J]. 黑龙江八一农垦大学学报,2016,28(06):65-68.

[9] 覃杰,龙杰,张伟,张浩钿. 新疆铁门关地区奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及主要病原菌药敏试验[J]. 中国奶牛,2014,32(21):24-26.

[10] 贾林军,苏艳. 新疆昌吉地区大肠杆菌致奶牛隐性乳房炎的调查与分析[J]. 湖北畜牧兽医,2014,35(01):5-7.

[11] 陈坤永，翁良树，吴慕贞,等.深圳地区奶牛临床型乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验[J].中国兽医科技,1999,29(9):36-38.

[12] 伍清林，金兰梅,等. 乳牛舍内环境空气中细菌数量与乳房炎的关系研究[J].中国奶牛, 2010, 28(01):39-41.